产组织型纤溶酶原激活剂CHO工程细胞无血清培基的研究

在对ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１∶１）进行优化的基础上，以细胞生长和组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）表达为评价指标，筛选无血清培基添加成分，建立了由优化ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）、胰岛素、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８、维生素Ｃ、乙醇胺和微量元素混合液组成的适于产ｔ－ＰＡＣＨＯ工程细胞４Ｂ３生长和ｔ－ＰＡ表达效果均优于相同条件下用含血清培基培养的效果。

产尿激酶原CHO工程细胞无血清培基的研究

在分析产尿激酶原CHO工程细胞对培基中氨基酸和糖利用的基础上,对DMEM:F12(1:1)进行初步优化。采用正交实验设计建立了无血清培基11G-SG-SFM和11G-SE-SFM。用11G-SG-SFM悬浮培养11G细胞,细胞增殖速率与含5％小牛血清DMEM:F12或CHO-S-SFM相当。用11G-SE-SFM培养11G细胞,细胞增殖缓慢,但有利于提高11G细胞表达pro-UK的水平,pro-UK的表达水平比含5％小牛血清的DMEM:F12培养提高80％左右。

多孔微球固定化CHO工程细胞生产rt-PA的研究

以 Ｃｙｔｏｐｏｒｅ 多孔微球固定产重组组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔ Ｐ Ａ） Ｃ Ｈ Ｏ 工程细胞株４ Ｂ３ ，在２ Ｌ 搅拌式生物反应器用无血清培养基 Ｄ Ｆ５ Ｓ 连续灌流培养。４ Ｂ３ 细胞的最大活细胞密度和ｒｔ Ｐ Ａ 生产水平分别达到８８３ ×１０６／ ｍ Ｌ 和１２４７３ Ｉ Ｕ／ ｍ Ｌ。含ｒｔ Ｐ Ａ 的４ Ｂ３ 细胞培养上清经 Ｍ Ｐ Ｇ 吸附层析和 Ｌｙｓｉｎｅｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ 亲和层析两步纯化，ｒｔ Ｐ Ａ 的纯度达到９８ ％ 。

用天冬酰胺代替谷氨酰胺培养产尿激酶原CHO工程细胞

以产尿激酶原CHO工程细胞CL - 11G的细胞生长和目的产物的表达为观察指标 ,对用天冬酰胺替代培养基中谷氨酰胺的可行性进行研究。结果表明 ,溶液中游离态的天冬酰胺的自发分解速度明显低于谷氨酰胺 ,用天冬酰胺替代培基中的谷氨酰胺培养 11G细胞不影响细胞的生长和目的产物的表达 。

用改装的Super-Spinner搅拌瓶连续灌流培养产凝血酶原CHO工程细胞

A Super\|Spinner was Modified by mounting a stainless steel filter(pore size 75 μm)to the impeller shaft to retain cells while fresh nutrient is perfused.Using Macroporous microcarrier Cytopore 1,continuously perfused cultivation of a recombinant CHO cell line,CHO2DS producing prothrombin was performed with the perfusion of a protein\|free medium DF6S.The cell retention rate was more than 90% during the 24 days continuously perfused cultivation.The viable cell density of CHO2DS and prothrombin concentration reached 4.62×10 6(cells.m/L) and 11.3(mg/L)respectively after 9 days culture.

CHO工程细胞(11G-S)悬浮培养的无血清培养基的设计

以悬浮适应的表达重组尿激酶原(Pro-urokinase,pro-UK)CHO工程细胞系11G-S为对象,采用Plackett-Burman实验设计及响应面分析法,设计支持CHO工程细胞(11G-S)悬浮生长的无血清培养基。以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计对影响细胞生长的培养基添加成分进行考察,确定了3种对细胞生长明显促进作用的培养基添加成分:胰岛素、转铁蛋白及腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种适用于CHO工程细胞(11G-S)悬浮培养的无血清培养基SFM-CHO-S。11G-S细胞在SFM-CHO-S批次悬浮培养的细胞最大生长密度达到4.12×106cells/mL,pro-UK的最大累积活性达到5614IU/mL,培养效果优于商品化的同类无血清培养基。

CHO工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型

以悬浮适应的表达尿激酶原CHO工程细胞为研究对象,在100mL的摇瓶中进行无血清悬浮培养,以细胞密度、细胞活力、Pro-UK活性、葡萄糖比消耗速率(qglc)、乳酸比生产速率(qlac)、乳酸对葡萄糖的得率系数(Ylac/glc)为观察指标,同时以细胞有血清悬浮培养作为参照,考察CHO工程细胞无血清悬浮培养生长和代谢特征。观察结果表明,CHO工程细胞在无血清及有血清悬浮培养条件下表现为大致相似的细胞生长和代谢特征。在此基础上,依据实际检测的数据,应用MATLAB软件对细胞对数生长期的细胞生长、乳酸生成及葡萄糖消耗的模型参数进行非线性规划,获得全局性收敛的最优参数估计值,建立了细胞在无血清培养条件下的生长及代谢动力学模型。

5L生物反应器中长期灌流培养CHO工程细胞生产rt-PA

目的 :利用 5L反应器培养CHO工程细胞生产重组组织型纤溶酶原激活剂 (recombinanttissueplasminogenactivator ,rt PA)。 方法 :在 5L搅拌式生物反应器中采用Cytopore1多孔微载体和无血清培基DF5S连续灌流培养CHO工程细胞株 4B3。结果 :持续培养达 10 3d ,活细胞密度和rt PA生产水平分别达到 6 .52× 10 6 个细胞 /ml和 1716 1U/ml。细胞培养上清经StreamlineSP离子交换层析和Lysine Sepharose 4B亲和层析两步纯化 ,获得纯度达到 98%的rt PA。SDS PAGE分析表明 ,整个培养过程所生产的rt PA具有较好的质量一致性。产品热原检测合格。结论 :实现高密度长期培养 4B3细胞 ,确定 5L培养工艺 。

丙戊酸钠和锌离子对CHO工程细胞抗体产量的影响

目的考察流加补料培养工艺中丙戊酸钠、锌离子及其浓度对表达单克隆抗体的CHO工程细胞抗体产量的影响。方法通过单因素试验筛选丙戊酸钠提高抗体产量的最佳浓度,以及可促进细胞生长并提高抗体产量的流加物质(氨基酸类、维生素类、金属离子等)及其最佳浓度。利用Minitab 17软件考察丙戊酸钠和锌离子两因子的交互作用,得到其最优水平,并进行验证。结果细胞培养第8天单次添加终浓度为1.5 mmol/L的丙戊酸钠,可使抗体产量提高(81.5±9.7)%;锌离子可促进细胞生长并明显提高抗体产量,细胞培养第3天开始,每24 h添加终浓度为90μmol/L的锌离子,可使抗体产量提高(38.3±4.3)%。丙戊酸钠和锌离子组合使用可使抗体产量分别比其单独使用提高27.0%和63.8%。结论组合使用丙戊酸钠、锌离子对CHO工程细胞抗体产量提高的比例明显优于单独使用,可能是丙戊酸钠促进抗体表达的同时抑制细胞生长,限制其提高抗体产量的潜力,锌离子的加入可减弱丙戊酸钠对细胞生长的影响,组合使用可更高效地表达抗体。

应用荧光原位杂交技术检测康柏西普基因在CHO细胞染色体上的整合状态

CHO细胞是常用的哺乳动物表达工程细胞。外源基因整合至CHO细胞染色体后,在大规模蛋白质生产过程中,由于相关压力撤除,外源基因存在丢失的可能,因此有必要对其整合稳定性进行检测。康柏西普(conbercept)是一个能够特异性结合VEGF-A的各种异构体、VEGF-B以及PlGF,从而发挥抗血管生成活性的融合蛋白。康柏西普目前已在美国进入Ⅲ期临床试验。本文运用荧光原位杂交对康柏西普基因在CHO细胞的整合状态进行了检测,发现经过4和19次传代后,康柏西普基因依然能稳定整合在基因组上,并且呈现出3个特点:(1)分布在一条染色体上,而不是多条染色体上;(2)分布在较长的染色体上;(3)在同一染色体上有较多拷贝数。同时,荧光定量PCR结果证明基因拷贝数无明显改变,ELISA检测证明蛋白表达水平亦无明显改变。上述实验证明在经过19次传代以后,康柏西普基因仍然稳定整合在基因组中,并可活跃表达,为康柏西普大规模生产及产品质控提供了有力依据。

HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体的构建及其稳定表达细胞株的建立

目的:构建HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体,并运用Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达该细胞的CHO工程细胞株。方法:应用PCR技术以pcMV-e23sFv-Fdt-tBid为模板扩增e23sFv-Fdt-tBid片段,并将其克隆入pcDNA5/FRT载体中;通过Flp-InTM定点整合表达系统将e23sFv-Fdt-tBid整合入Flp-lnTM CHO细胞的基因组中一个单拷贝位点上,以适当的潮霉素B筛选定点整合e23sFv-Fdt-tBid cDNA的细胞克隆;通过基因组PCR技术和Westernblot技术检测e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达。结果:成功构建了pcDNA5/FRT-e23sFv-Fdt-tBid表达载体;成功通过Flp-InTM定点整合表达系统建立稳定表达e23sFv-Fdt-tBid蛋白的CHO工程细胞株;成功通过基因组PCR技术及基因组PCR技术和Western blot技术检测了e23sFv-Fdt-tBid基因的整合及该蛋白表达。结论:成功地构建了HER2靶向免疫促凋亡蛋白e23sFv-Fdt-tBid真核表达载体并建立了稳定表达该蛋白的CHO工程细胞株,为该蛋白的应用研究奠定了重要基础。

中国仓鼠卵巢工程细胞无血清流加培养关键工艺参数的考察

主要考察流加培养基中不同营养成分、流加起始时间及初始接种密度对11G-S细胞无血清流加培养的影响。在研究中以悬浮适应的表达尿激酶原（Pro-urokinase,Pro-UK）CHO工程细胞系11G-S为研究对象,在100 mL的摇瓶中无血清悬浮流加培养11G-S细胞,同时以活细胞密度、细胞活力及Pro-UK活性为评价依据。结果表明在培养基中氨基酸、无血清添加成分及无机盐对促进细胞生长、细胞活力维持及蛋白表达起着较为重要的作用;且流加起始时间为72 h及初始接种密度为3×105~4×105 cells/mL的流加培养效果较好。在为期12 d的流加培养过程中,11G-S细胞的最大活细胞密度达到7.8×106 cells/mL,Pro-UK的最大累积活性为8 570 IU/mL。在此基础上,分别考察了无血清悬浮流加培养及分批培养11G-S细胞的生长及代谢特征,流加培养中期11G-S细胞的比生长速率（μ）高于同期批次培养的11G-S细胞;流加培养中后期11G-S细胞的葡萄糖比消耗速率（qglu）和谷氨酰胺比消耗速率（qgln）均高于同期批次培养的11G-S细胞。