茯苓酸通过Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路调控铁死亡改善阿尔茨海默病大鼠认知障碍的研究

背景阿尔茨海默病(AD)是一种常见且不可逆转的神经退行性脑疾病,严重影响患者的生活品质和生存质量,目前仍缺乏有效的治疗方法延缓或阻止疾病进展。中药及其活性成分在防治AD方面具有重要潜力。目的探讨茯苓酸(PA)对AD大鼠认知障碍及核因子E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体家族7A11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路的影响。方法2022年1—9月将75只6~8周龄雄性SPF级SD大鼠依据随机数字表法分为对照组(Control组)、AD模型组(Model组)、PA治疗组(PA组),PA+Nrf2抑制剂组(PA+ML385组),除Control组外制备AD大鼠模型。造模成功后,PA组腹腔注射50 mg/kg PA,PA+ML385组腹腔注射50 mg/kg PA+30 mg/kg Nrf2抑制剂ML385,Control组与Model组腹腔注射等量0.9%氯化钠溶液。末次给药24 h后进行Morris水迷宫实验,第2、4、6天进行定位航行实验,记录大鼠到达平台的时间(逃避潜伏期),第7天移走平台,记录大鼠在120 s内滞留平台时间和穿越平台次数。Nissl染色后观察各组大鼠海马神经元病理变化,普鲁士蓝染色检测海马组织铁沉积,免疫荧光染色检测海马神经元GPX4表达,检测海马组织谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、Fe2+含量,蛋白质印迹法(Western blotting)检测大鼠海马组织Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达。结果末次给药第2、4、6天Model组逃避潜伏期高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组平台停留时间、穿越平台次数低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。Nissl染色结果示Model组神经元坏死严重,细胞核皱缩,尼氏体数目减少;PA组神经元坏死减少,排列紧密且尼氏体增多;PA+ML385组神经元损伤明显加重,尼氏体数目减少。普鲁士蓝染色结果示Model组铁沉积较Control组增加,与Model组比较,PA组铁沉积减少,PA+ML385组较PA组铁沉积增多。免疫荧光染色结果示Model组绿色荧光减弱,GPX4阳性细胞减少,PA组细胞绿色荧光较Model组增强,GPX4阳性细胞增多,PA+ML385组较PA组GPX4阳性细胞减少。Model组GSH低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05);Model组MDA、Fe2+高于Control组、PA组,PA+ML385组高于PA组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Model组Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白相对表达量低于Control组、PA组,PA+ML385组低于PA组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PA可改善AD大鼠认知障碍,其机制可能与通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡有关。

精氨酸甲基转移酶(PRMT)7通过IGF-1信号通路调控人骨髓间充质干细胞成脂分化的研究

目的本研究旨在明确精氨酸甲基转移酶(PRMT)7在人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)成脂分化过程中的变化以及是否调控hBMSCs成脂分化,进而探索相应的调控机制。方法通过定量反转录PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测hBMSCs成脂分化过程中PRMT7的变化;通过qRT-PCR和Western blot实验证明PRMT7稳定敲低细胞系构建成功。进行油红O染色和定量分析,以及qRT-PCR和Western blot实验检测PRMT7稳定敲低细胞系成脂分化水平的变化;通过裸鼠体内异位成脂实验,油红O染色检测PRMT7稳定敲低细胞系体内异位成脂的效果;通过qRT-PCR和Western blot证明PRMT7稳定过表达细胞系构建成功。进行油红O染色和定量分析以及qRT-PCR和Western blot实验检测PRMT7稳定过表达细胞系成脂分化水平的变化;通过q RT-PCR和Western blot实验检测敲低PRMT7和过表达PRMT7的细胞中IGF-1表达水平的变化。在PRMT7稳定敲低细胞系中转染siIGF-1并通过qRT-PCR和Western blot检测IGF-1的表达水平验证敲低效率。通过油红O染色和定量分析,qRT-PCR实验检测转染siIGF-1的敲低组hBMSCs成脂分化水平的变化。结果本文发现:在hBMSCs成脂过程中,PRMT7表达水平明显降低(P<0.01);敲低PRMT7后hBMSCs的成脂分化能力增强(P<0.001);敲低PRMT7后hBMSCs的体内异位成脂分化能力增强;过表达PRMT7后hBMSCs的成脂分化能力减弱(P<0.01);PRMT7敲低后IGF-1表达水平增加(P<0.0001);PRMT7过表达后IGF-1表达水平降低(P<0.0001);转染siIGF-1后,各细胞系IGF-1表达水平明显降低(P<0.001);敲低组转染siIGF-1后成脂分化能力明显降低(P<0.01)。结论本研究通过细胞水平和裸鼠皮下移植实验发现PRMT7显著抑制hBMSCs成脂分化,机制研究发现PRMT7对hBMSCs成脂分化的调控作用依赖IGF-1信号通路。上述研究表明,PRMT7可能是治疗相关疾病的潜在分子靶点,为PRMT7和hBMSCs应用于相关疾病治疗提供了新思路。

基于Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路探讨附芍地芩方抗结直肠癌作用机制

目的探讨附芍地芩方治疗结直肠癌的作用机制。方法体外细胞实验用附芍地芩方处理结直肠癌CT-26细胞,检测细胞增殖、迁移能力。流式细胞术检测结直肠癌CT-26细胞的活性氧(ROS)水平,并检测其铁离子(Fe^(2+))、丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性。PCR Array与Western blot方法分析验证铁死亡差异基因表达情况。体内动物实验将Balb/c小鼠随机分为空白对照组、模型组、奥沙利铂组(1.5 mg·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方低剂量组(4.49 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方中剂量组(8.97 g·kg^(-1)·d^(-1))、附芍地芩方高剂量组(17.94 g·kg^(-1)·d^(-1)),检测附芍地芩方对小鼠肿瘤组织Fe^(2+)、ROS、MDA水平,SOD活性及Nrf2、Keap1、SLC7A11、GPX4表达水平的影响。结果体外细胞实验显示,与空白对照组相比,附芍地芩方通过剂量依赖的方式显著抑制了结直肠癌CT-26细胞的增殖与迁移。附芍地芩方可以提高结直肠癌CT-26细胞中的Fe^(2+)(P<0.05)与ROS水平(P<0.01);提高结直肠癌CT-26细胞内MDA水平(P<0.01),并显著降低SOD活性(P<0.01)。铁死亡PCR Array分析发现,与空白对照组比较,附芍地芩方干预后,基因GPX4、SLC7A11表达显著下调,GSTA1、HMOX1、Ca9、Chac1、Keap1、Sqstm1、NOX1、FTH1、Tfr1、SAT2、Pparg、Hamp表达显著上调。Western blot实验检测发现,附芍地芩方干预后,结直肠癌CT-26细胞Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。体内动物实验结果显示,附芍地芩方显著抑制小鼠皮下移植瘤的生长(P<0.05),肿瘤组织坏死程度增加,Fe^(2+)、ROS以及MDA水平增加(P<0.05,P<0.01),SOD活性下降(P<0.01),且肿瘤组织中Keap1蛋白表达上调(P<0.01),Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达下调(P<0.01)。结论附芍地芩方具有抗结直肠癌作用,并可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进结直肠癌细胞铁死亡以发挥抗结直肠癌作用。

SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路促进细胞炎症因子释放

目的:探究SARS-CoV-2辅助蛋白ORF7a介导NF-κB激活,进而诱导炎症因子产生的分子机制。方法:双荧光素酶报告基因试验检测ORF7a对NF-κB激活的影响,qRT-PCR检测ORF7a对细胞中炎症因子表达的影响,Western blot、核质分离及免疫荧光技术检测ORF7a蛋白对p65磷酸化及入核的影响,免疫共沉淀及免疫荧光技术检测ORF7a的作用靶标蛋白。结果:报告基因试验表明ORF7a显著激活NF-κB启动子活性,并呈剂量依赖性(P<0.001),而对AP-1报告基因的激活无明显影响。ORF7a显著上调细胞因子TNF-α、IL-β及IL-8 mRNA表达(P<0.05)。Western blot结果显示ORF7a显著增强p65蛋白磷酸化(P<0.05)及p65的入核(P<0.01)。免疫共沉淀实验发现ORF7a与NF-κB信号通路分子IKKβ蛋白存在相互作用,免疫荧光实验也证实ORF7a与IKKβ具有共定位。结论:SARS-CoV-2 ORF7a通过靶向IKKβ激活NF-κB信号通路,进而促进细胞中炎症因子的释放。

抗奥合剂通过p38 MAPK/NF-κB信号通路和ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解急性肺损伤研究

目的探讨抗奥合剂(KAHJ)治疗小鼠急性肺损伤(ALI)的作用及机制,为其可能作为缓解新型冠状病毒(COVID-19)感染后症状的药物提供依据。方法采用网络药理学方法预测KAHJ治疗ALI的主要活性成分、潜在靶点和相关信号通路。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、LPS组和LPS+KAHJ组。LPS+KAHJ组小鼠灌胃KAHJ(4.76 g·kg^(-1)·d^(-1),8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1)),其余组小鼠灌胃生理盐水(8.8 mL·kg^(-1)·d^(-1))。14 d后,腹腔注射LPS(5 mg·kg^(-1))诱导ALI模型。收集小鼠血清和肺组织,通过组织病理学观察肺组织的病理变化。采用Western blot、qPCR、ELISA和IHC等方法评估KAHJ对ALI的改善作用。结果通过网络药理学筛选出疾病和药物共同的70个核心靶基因,并显示与多个信号通路密切相关,如MAPK、NF-κB、Apoptosis、COVID-19和肾素-血管紧张素系统(Ras)信号通路等。此外,通过实验验证发现KAHJ能改善小鼠ALI后的炎症和细胞凋亡,减少肺损伤和肺水肿,抑制肺纤维化。同时,KAHJ的作用机制与p38 MAPK和NF-κB的磷酸化以及ACE2/Ang1-7/Mas轴的调控也有着密切关系。结论KAHJ可能通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路和调控ACE2/Ang1-7/Mas轴缓解ALI,为缓解COVID-19感染后症状提供了补充和替代药物。

黄芪多糖通过调控Wnt信号通路对关节炎大鼠软骨细胞凋亡及CHRNA7/MMP水平的影响

目的 探究黄芪多糖通过调控Wnt信号通路对关节炎大鼠软骨细胞凋亡及CHRNA7/基质金属蛋白酶(MMP)水平的影响。方法 选取40只SPF级SD雄性大鼠,随机分为正常(A)组,模型(B)组,塞来昔布(C)组,黄芪多糖(D)组,每组10只,对B、C、D组采用关节腔注射木瓜蛋白酶和L-半胱氨酸建立骨关节炎大鼠模型,A组不建立该模型,建模成功后,对C组给与灌胃20 mg/kg的塞来昔布,对D组给与灌胃400 mg/kg的黄芪多糖,A组、B组同期给与灌胃同体积生理盐水,观察大鼠关节炎指数及关节肿胀度,HE染色法检测大鼠软骨组织病理形态,TUNEL法检测软骨细胞凋亡,Real-time PCR法检测大鼠血清中CHRNA7 mRNA相对表达水平,ELISA法检测大鼠血清中MMP水平,免疫印迹法检测Wnt信号通路相关蛋白表达。结果 与A组相比,B组大鼠关节指数评分及肿胀度显著升高(P<0.05),与B组相比,C组、D组大鼠关节指数评分及肿胀度均显著降低(P<0.05),且D组比C组降低明显(P<0.05);A组软骨组织表面光滑、平整,细胞排列规则、清楚,且潮线清晰,软骨层可见少量血管翳,B组软骨组织表面凹凸不平,软骨层变薄,细胞排列极为紊乱,部分切片表层缺失,潮线模糊不清,可见多处裂隙及大量血管翳,与B组相比,C组、D组症状明显改善,软骨细胞数量明显增多,血管翳明显减少;与A组相比,B组软骨细胞凋亡显著升高(P<0.05),与B组相比,C组、D组软骨细胞凋亡均显著降低(P<0.05),且D组比C组降低明显(P<0.05);与A组相比,B组血清中CHRNA7、基质金属蛋白酶(MMP1、MMP3、MMP7、MMP13)水平显著升高(P<0.05),与B组相比,C组、D组血清中CHRNA7、MMP1、MMP3、MMP7、MMP13水平均显著降低(P<0.05),且D组比C组降低明显(P<0.05);与A组相比,B组软骨组织中DKK1蛋白表达显著升高(P<0.05),β-catenin显著降低,与B组相比,C组、D组DKK1显著降低(P<0.05),β-catenin显著升高(P<0.05),且D组比C组变化明显(P<0.05),而E组与D组相比差异无统计学意义(P>0.05),F组比E组变化明显(P<0.05)。结论 黄芪多糖可显著抑制关节炎大鼠软骨细胞凋亡,降低CHRNA7/MMP水平,其机制可能与激活Wnt信号通路有关。

苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响

目的探讨苍术素调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对脑胶质瘤细胞铁死亡的影响及其机制。方法体外培养脑胶质瘤U251细胞,将U251细胞分为对照组、苍术素低剂量组(5 mol/L)、中剂量组(10 mol/L)、高剂量组(20 mol/L)、ML385组(Nrf2抑制剂1 mol/L)。MTT和Edu实验检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率;试剂盒检测亚铁离子(Fe^(2+))、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)水平;Western blot检测Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达;建立脑胶质瘤裸鼠模型,观察肿瘤生长情况,检测肿瘤组织中Ki-67、cleaved-caspase3、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白水平。结果细胞实验结果显示,与对照组比较,苍术素低、中、高剂量组U251细胞Fe^(2+)、MDA、LDH、ROS水平、细胞凋亡率、cleaved-caspase3水平显著性升高,GSH水平、OD490(24 h、48 h)值和细胞增殖率、Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与苍术素高剂量组比较,ML385组U251细胞各检测指标水平无统计学差异(P>0.05);裸鼠成瘤实验结果表明,与模型组比较,苍术素组和ML385组裸鼠肿瘤质量和肿瘤体积、裸鼠肿瘤组织中Ki-67、Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表达水平显著性降低,cleaved-caspase3蛋白表达水平显著性升高(P<0.05);与苍术素组比较,ML385组裸鼠肿瘤质量、肿瘤体积、抑瘤率和各蛋白表达水平无统计学差异(P>0.05)。结论苍术素可能通过抑制Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路促进脑胶质瘤细胞铁死亡。

白藜芦醇通过激活p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制铁死亡减少脑缺血再灌注损伤

目的探讨白藜芦醇对脑缺血再灌注后铁死亡的抑制作用及其机制。方法250~280 g的SPF级SD雄性大鼠63只,随机分为假手术组、脑缺血再灌注组(MCAO/R)组、白藜芦醇组。利用线栓法建立大鼠疾病模型。给药组剂量为30 mg/kg。给药28 d后应用Zea-longa评分评估大鼠神经功能。给药24 h取材大鼠脑组织,通过称重法评估脑水肿情况,应用免疫荧光染色检测谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),长链脂酰辅酶A合成酶4(long chain lipoyl coenzyme A synthetase 4,ACSL4)。试剂盒检测各组脑组织中Fe^(2+)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malonaldehyde,MDA)水平。利用蛋白免疫印记(Western Blot)对不同组别的大鼠脑组织中p53、SLC7A11以及GPX4蛋白表达进行检测。结果与损伤组相比,白藜芦醇治疗组Zea-longa评分和脑组织水含量、Fe^(2+)、MDA明显降低,GSH、SOD表达明显增加;免疫荧光染色结果显示,GPX4表达明显增强、ACSL4表达降低。WB通路蛋白结果显示,白藜芦醇治疗组P53表达降低,SLC7A11表达升高。结论白藜芦醇通过调控p53/SLC7A11/GPX4信号通路抑制MCAO/R大鼠铁死亡,进而促进缺血再灌注大鼠神经功能恢复。

过表达CBX7调控PTEN/Akt信号通路干预上皮-间充质转化抑制胃癌细胞迁移、侵袭

目的探讨染色体盒蛋白同源物7(CBX7)对胃癌细胞上皮-间充质转化(EMT)、迁移、侵袭的影响及相关作用机制。方法将CBX7过表达质粒和阴性对照质粒、CBX7 siRNA和阴性对照siRNA转染至体外培养的人胃癌细胞SGC7901。采用qRT-PCR和Western blot法检测细胞中CBX7的mRNA和蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移情况,Transwell小室检测细胞侵袭情况,Western blot法检测细胞中EMT相关蛋白和磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白表达。结果与pcDNA-NC组比较,pcDNA-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著下降/减少,细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、PTEN蛋白表达量均显著升高,N-钙黏蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)蛋白表达量、p-Akt/Akt均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CBX7组SGC7901细胞存活率、迁移率及侵袭数均显著升高/增加,细胞中E-cadherin、PTEN蛋白表达量均显著下降,N-cadherin、Vimentin蛋白表达量和p-Akt/Akt均显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达CBX7可通过抑制EMT进程抑制胃癌细胞迁移、侵袭,其作用机制可能与调控PTEN/Akt信号通路有关。

BMP-7/Smads信号通路在胆总管结扎大鼠肝纤维化组织中的表达及意义

目的探讨BMP-7/Smads信号通路在胆总管结扎大鼠肝纤维化组织中的表达及意义。方法将雄性Wistar大鼠简单随机化分组成假手术组,胆总管结扎7天组、14天组、28天组、42天组,采用胆总管结扎方法制备大鼠胆汁淤积肝纤维化模型。苏木精-伊红染色、Msaaon染色观察各组大鼠肝组织形态及胶原沉积情况,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)测各组大鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、纤连蛋白(fibronectin,FN)等肝纤维化指标mRNA的表达变化,免疫组化法明确肝脏胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠ)沉积情况,Western blot法检测各组肝组织内FN、collagenⅠ、胶原蛋白Ⅲ(collagenⅢ)、α-SMA和金属基质蛋白酶组织抑制因子1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMP1)等蛋白的表达,同时用免疫组化法及Western blot法检测各组肝组织内BMP-7及p-Smad1/5/8蛋白定位及表达量的变化。结果与假手术组比较,胆总管结扎组随着胆总管结扎时间延长,肝纤维化程度逐渐加重,肝内胶原增生明显,形成粗大的纤维间隔,肝组织内FN、α-SMA、collagenⅠ、collagenⅢ及TIMP1蛋白的表达明显增多,且差异有统计学意义(P<0.05),在肝纤维化组织内,BMP-7及p-Smad1/5/8蛋白在肝纤维化早期显著升高,随着纤维化程度加重,其表达逐渐减少,与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论BMP-7/Smads信号通路在大鼠肝纤维化早期明显激活,作为一种保护性措施发挥内源性保护作用,而随着肝纤维化的进展,BMP-7/Smads信号通路的激活程度逐渐减弱,这一作用逐渐被削弱。

五味子对对氯苯丙氨酸致失眠大鼠Toll样受体7信号通路相关基因mRNA表达的影响

目的:研究五味子对对氯苯丙氨酸(PCPA)致失眠大鼠Toll样受体7(TLR7)信号通路相关基因mRNA表达的影响。方法:将32只大鼠随机分为空白组、模型组、五味子组、安定组,每组8只。模型组、五味子组、安定组大鼠腹腔注射PCPA建立失眠模型。五味子组给予五味子提取物灌胃,安定组给予地西泮混悬液灌胃,余组不予处理。采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测各组大鼠脾脏TLR7、干扰素调节因子7(IRF7)、干扰素α(IFN-α)的mRNA水平。结果:造模后,模型组大鼠体质量下降,出现毛少无光、易受惊、烦躁易怒、昼夜节律消失等现象。模型组、安定组大鼠体质量均低于空白组(P<0.05)。给予五味子提取物灌胃后,五味子组与空白组大鼠体质量比较,差异无统计学意义(P>0.05),两组大鼠身体状态均相对较好,毛发有光泽,白天安静倦卧,无烦躁、易怒等症状。荧光定量PCR仪检测结果显示,模型组TLR7、IRF7、IFN-α的mRNA表达水平均明显高于空白组(P<0.01);五味子组、安定组TLR7、IRF7 mRNA表达水平均明显低于模型组(P<0.01);安定组IFN-α mRNA水平低于模型组(P<0.05)。结论:五味子能改善PCPA诱导失眠大鼠的睡眠,其机制可能是通过下调TLR7信号通路的相关基因发挥治疗作用。

BMP/Smad信号通路与先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部的软骨发育

背景:先天性马蹄内翻足主要表现为骨本身异常及软骨发育异常,BMP/Smad信号通路可以指导胚胎期骨和软骨的发育,但其在马蹄内翻足病因领域发挥的作用尚无动物实验证实。目的:探讨BMP/Smad信号通路参与调控先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨发育异常的机制。方法:将生长状况相同的孕10 d的SD大鼠随机分为实验组和对照组。实验组采用135 mg/kg维甲酸灌胃制作马蹄内翻足模型,对照组采用等量植物油灌胃;孕21 d后剖腹取出胎鼠,实验组孕鼠产下胎鼠41只中出现马蹄足畸形27只,畸型率65.9%;对照组获得胎鼠36只,均未出现畸形。分离胎鼠足踝部组织进行苏木精-伊红染色,并采用Western blot、RT-qPCR、免疫组化检测BMP/Smad信号通路核心蛋白Smad5、P-Smad5、通路下游蛋白SP7以及Sox9的表达水平。结果与结论:①与对照组相比,苏木精-伊红染色可见实验组大鼠足踝部组织中软骨基质增多,骨间缝隙增大;②免疫组化显示实验组Smad5与SP7表达水平下降,而Sox9基因表达增高;③RT-qPCR结果显示实验组大鼠足踝部组织中Smad5、SP7的mRNA表达水平下降,Sox9 mRNA表达水平升高;④Western blot结果显示实验组大鼠足踝部软骨组织中P-Smad5/Smad5及SP7表达降低,Sox9表达升高;⑤结果说明,先天性马蹄内翻足模型大鼠足踝部软骨异常的发生与BMP/Smad信号通路传导障碍有关。

基于p53/SLC7A11/GPX4信号轴探讨七叶内酯诱导小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的作用机制

目的:探讨七叶内酯对小鼠乳腺癌4T1细胞铁死亡的影响及其作用机制。方法:对七叶内酯与p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)进行分子对接,并绘制Kaplan-Meier和time ROC曲线。将4T1细胞分为对照组、1/2 IC_(50)组、IC_(50)组、2 IC_(50)组、erastin组和卡培他滨组。采用CCK-8法观察4T1细胞活力情况,筛选药物干预浓度;电镜观察4T1细胞线粒体形态,评估线粒体损伤情况;试剂盒检测4T1细胞活性氧(ROS)、Fe2+、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和GPX4的水平;采用划痕和Transwell小室实验检测4T1细胞侵袭和迁移能力;Western blot检测p53、SLC7A11、GPX4和酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)的表达水平。结果:与对照组相比,七叶内酯1/2 IC_(50)、IC_(50)和2 IC_(50)组细胞活力,GSH和GPX4表达水平,侵袭和迁移能力,以及SLC7A11和GPX4蛋白表达水平均降低,细胞线粒体变小,膜密度增高,嵴减少(P<0.05),Fe2+、ROS和MDA水平及p53和ACSL4蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:七叶内酯可促进4T1细胞铁死亡,其作用机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路相关。

基于肉瘤基因信号通路探讨槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞的作用机制

目的:探讨槲皮素通过RAS/RAF/MEK1信号通路对乳腺癌MCF-7细胞的作用机制。方法:将乳腺癌MCF-7细胞分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组,采用CCK-8细胞活力检测法测定不同组别的MCF-7细胞24 h、48 h、72 h的细胞活性;采用流式细胞术检测不同组别MCF-7细胞的凋亡率;采用蛋白质印迹法检测不同组别MEK1、RAS、YAP蛋白的表达;采用免疫荧光染色观察雌激素受体、孕激素受体染色情况。结果:与空白对照组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组及极高剂量组的MCF-7细胞活力均出现下降,呈浓度依赖,不具有时间依赖性,差异有统计学意义(P<0.05);乳腺癌细胞MCF-7的晚期凋亡率明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组、中剂量组和极高剂量组MCF-7细胞的MEK1、RAS、YAP蛋白的表达出现不同程度下降,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组、中剂量组、高剂量组及极高剂量组的MCF-7细胞中雌激素受体、孕激素受体表达增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:槲皮素具有针对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤作用,且具有浓度依赖性,其机制可能与对RAS/RAF/MEK1信号通路的抑制有关。

lncRNA DLEU2/miR-455-3p/OTUD7B轴通过PI3K/AKT信号通路促进宫颈癌恶性发展

目的:探讨长链非编码RNA DLEU2(lncRNA DLEU2,DLEU2)对宫颈癌恶性发展的影响。方法:利用TCGA数据库和qRT-PCR分析DLEU2在宫颈癌组织和细胞系中的表达。采用CCK-8、Western blotting、免疫荧光、细胞划痕、Transwell和TUNEL实验检测干扰DLEU2(sh-DLEU2)对宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。生物信息学和双荧光素酶报告基因实验分析DLEU2和miR-455-3p的靶基因,评估miR-455-3p inhibitor/mimic对宫颈癌细胞生长和PI3K/AKT信号通路的影响。裸鼠荷瘤实验检测干扰DLEU2后对瘤体体内生长的影响。结果:宫颈癌组织和细胞系中DLEU2表达显著上调(P<0.01)。sh-DLEU2可抑制Hela和SiHa细胞的增殖、迁移和侵袭(P<0.01),促进细胞凋亡(P<0.001)。DLEU2与miR-455-3p相结合,OTUD7B为miR-455-3p的靶基因。miR-455-3p inhibitor促进细胞恶性发展并激活PI3K/AKT信号通路,而sh-DLEU2可逆转其作用(P<0.01);miR-455-3p mimic也可部分逆转Oe-OTUD7B对细胞的作用(P<0.01)。此外,sh-DLEU2抑制了裸鼠荷瘤组织的生长(P<0.01)。结论:DLEU2通过miR-455-3p/OTUD7B轴激活PI3K/AKT信号通路促进宫颈癌的恶性发展。

Krüppel样因子7促进创伤性颅脑损伤时JAK2/STAT3信号通路的活化和抑制神经元凋亡

目的 探讨Krüppel样因子7(KLF7)在创伤性颅脑损伤(TBI)后海马区细胞凋亡和神经功能障碍的保护作用及调控机制。方法 应用控制性皮质撞击(CCI)法建立小鼠TBI模型,侧脑室注射KLF7慢病毒(AAV-KLF7)过表达KLF7,Western bolt和实时荧光定量PCR检测小鼠海马内KLF7表达变化,Western bolt检测海马组织细胞凋亡因子、JAK2/STAT3信号通路关键因子及其磷酸化水平,TUNEL法检测海马组织神经元凋亡情况,甲酚紫染色检测各组动物大脑皮质损伤体积,神经功能评分和旋转杆实验检测神经功能障碍改变。结果 TBI后1 d,海马区KLF7蛋白和mRNA表达显著增高,3 d后恢复正常。TBI海马区Bax和Cleaved Caspase-3(C-Cas-3)水平、TUNEL阳性细胞百分比、脑皮质损伤体积百分比、p-STAT3/t-STAT3和p-JAK2/t-JAK2比值显著增加,Bcl-2水平显著降低,神经功能评分和旋转杆上运动时间均显著降低;侧脑室注射AAV-KLF7可促进TBI诱导的p-STAT3/t-STAT3和p-JAK2/t-JAK2比值增加,抑制TBI诱导的Bax和C-Cas-3水平增加。结论 KLF7可通过促进TBI对JAK2/STAT3信号通路的活化,减少TBI所致的神经元凋亡。

PRMT7通过调控Notch信号转导通路抑制膀胱癌细胞增殖和迁移

背景与目的:膀胱癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤之一,蛋白质精氨酸甲基转移酶7(protein arginine methyltransferase 7,PRMT7)在消化道肿瘤中的作用已有研究报道,但在膀胱癌中的生物学作用及机制尚未明确,本文旨在探究PRMT7对人膀胱癌细胞增殖和迁移能力的影响及其可能的作用机制。方法:体外培养人膀胱癌细胞系5637、T24、RT112、UM-UC-3和输尿管上皮永生化细胞系SV-HUC-1,采用蛋白质印迹法(Western blot)检测PRMT7的表达情况。采用RNA干扰技术沉默PRMT7基因的表达,设立阴性对照组(si-NC)及实验组(siPRMT7#1、siPRMT7#2),采用质粒转染法过表达PRMT7基因,设立阴性对照组(p-PCMV3)及实验组(p-PRMT7)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RTFQ-PCR)及Western blot验证PRMT7的转染效率,采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)和集落形成实验检测细胞增殖能力,采用transwell实验检测细胞迁移能力,采用Western blot检测增殖和迁移相关靶蛋白Cyclin D1、CDK4和MMP9以及Notch信号转导通路关键蛋白Notch1、HEY1和Hes1的表达情况。使用转染siPRMT7#2的细胞加入Notch信号特异性抑制剂γ-分泌酶抑制剂DAPT,进一步验证PRMT7在膀胱癌中的表达情况。结果:Western blot结果显示,PRMT7在膀胱癌细胞中低表达(P<0.05)。在5637细胞中沉默PTMT7后,细胞增殖和迁移能力显著增强(P<0.05),增殖和迁移相关靶蛋白Cyclin D1、CDK4和MMP9以及Notch信号通路关键蛋白Notch1、HEY1和Hes1的表达明显增加(P<0.05);而在T24细胞中过表达PRMT7后,呈相反的趋势。使用DAPT后,明显逆转了PRMT7在膀胱癌细胞中的表达。结论:PRMT7抑制膀胱癌细胞增殖和迁移,其作用机制与Notch信号转导通路有关。

姜黄素通过调控p53/SLC7A11/GPX4通路抑制脂多糖诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化

目的:探讨姜黄素(Cur)对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7源性破骨细胞的作用及其机制。方法:用LPS诱导RAW264.7细胞建立破骨细胞模型。CCK-8法检测RAW264.7细胞活力;TRAP染色鉴定破骨细胞形成;TRAP活性测定检测破骨细胞活力;生化检测细胞活性氧(ROS)、Fe^(2+)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)水平;透射电镜观察细胞线粒体形态;RT-qPCR检测p53、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的mRNA水平;Western blot检测p53、SLC7A11及GPX4蛋白水平。结果:LPS成功诱导RAW264.7细胞为破骨细胞。TRAP染色及TRAP活性结果显示,与LPS组相比,Cur组破骨细胞数量及TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01);与Con组相比,LPS+Erastin组TRAP活性显著升高(P<0.01),经Cur处理后,TRAP活性呈剂量依赖式下降(P<0.01)。生化检测结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组ROS、Fe^(2+)及MDA水平显著升高,GSH水平显著降低(P<0.01);与LPS+Erastin组相比,Cur组ROS、Fe^(2+)及MDA水平呈剂量依赖式下降(P<0.01),GSH水平呈剂量依赖式上升(P<0.01)。电镜结果显示,与LPS组比较,LPS+Erastin组细胞线粒体嵴减少,膜密度增加;经Cur处理后,细胞线粒体嵴明显增加,膜密度减小。RT-qPCR和Western blot结果显示,与Con组比较,LPS+Erastin组p53的mRNA和蛋白水平显著升高,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著降低(P<0.01);经Cur处理后,p53的mRNA和蛋白水平显著降低,SLC7A11和GPX4的mRNA和蛋白水平显著升高(P<0.01)。结论:Cur可抑制LPS诱导的RAW264.7源性破骨细胞分化,其机制可能与p53/SLC7A11/GPX4信号通路被抑制有关。

Smad7介导TGF-β信号通路对绵羊卵泡颗粒细胞增殖的影响

【目的】卵泡发育是一个复杂的调控过程,其中绵羊卵泡颗粒细胞(granulosa cells,GCs)的增殖,分化会直接影响卵泡的发育状况。TGF-β信号通路在绵羊卵巢发育和卵泡生长过程中起着重要作用,Smad7作为TGF-β信号通路关键性的抑制基因也发挥重要作用,通过探究Smad7介导TGF-β信号通路对绵羊卵泡GCs增殖凋亡的影响,为进一步研究Smad7在卵泡GCs增殖凋亡过程中的调控作用提供依据。【方法】选取4—6月龄未怀孕的晋中健康杜湖杂交母羊20只,屠宰后采集双侧卵巢组织,分离培养卵泡颗粒细胞,FSHR细胞免疫荧光鉴定,Smad7细胞免疫荧光的表达定位,CCK8法测定细胞增殖情况,绘制生长曲线;细胞传代后外源添加不同浓度Smad7激动剂积雪草苷(asiaticoside,AS)(0、100、200、400、600 ng·mL^(-1))培养绵羊卵泡GCs,选择AS最佳作用浓度处理二代颗粒细胞,采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平;合成3个siSmad7,转染至卵泡GCs中,选择干扰效果最佳的,采用实时荧光定量PCR和Western blotting检测TGF-β信号通路中关键基因及细胞凋亡和周期相关基因表达水平。【结果】Smad7在绵羊卵泡GCs中有表达;200 ng·mL^(-1) AS能极显著上调Smad7在GCs的表达(P<0.01),siSmad7-1对绵羊卵泡GCs的转染效果最佳(P<0.01);Smad7上调能显著增加TGF-β信号通路Smad4,TFDP-1和EP300的表达量(P<0.05),极显著增加TGF-β信号通路SP1的表达(P<0.01),显著增加凋亡相关基因Caspase8的表达量(P<0.05),极显著增加凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量(P<0.01),显著升高细胞周期相关基因P21和P27的表达量(P<0.05),极显著升高细胞周期相关基因CCND2的表达量(P<0.01),而CCND1的表达量显著降低(P<0.05);Smad7 siRNA显著降低TGF-β信号通路Smad4,TFDP-1和EP300的表达量(P<0.05),极显著降低TGF-β信号通路SP1的表达量(P<0.01),显著降低凋亡相关基因Caspase8的表达量(P<0.05),极显著降低凋亡相关基因Caspase3和Bim的表达量(P<0.01),极显著降低细胞周期相关基因P21,P27和CCND2的表达量(P<0.01),极显著升高CCND1的表达量(P<0.01);CCK8分析显示,Smad7上调,GCs的增殖率在24和48 h显著下调(P<0.01),Smad7 siRNA在24和72 h显著升高GCs的增殖率(P<0.05),在48 h极显著升高GCs的增殖率(P<0.01)。【结论】Smad7介导TGF-β信号通路抑制绵羊卵泡GCs增殖和促进细胞凋亡。

布洛芬对缺血性脑中风大鼠的神经保护作用及对Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路的影响

目的 探讨布洛芬调节核因子E2相关因子2(Nrf2)/非糖基化的x CT(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)信号通路对缺血性脑中风(IS)大鼠神经保护的作用。方法 48只以大脑中动脉梗死模型复制IS大鼠,将IS大鼠随机分为IS组、治疗组(30 mg/kg布洛芬)、抑制剂组(30 mg/kg ML385)、治疗+抑制剂组(30 mg/kg布洛芬+30 mg/kg ML385),其中以仅分离血管但不结扎的12只大鼠作为假手术组。干预结束后,对大鼠进行神经功能评分,检测大鼠脑梗死率以及脑水肿含量;取出大鼠脑组织,观察神经元形态学变化、检测铁离子含量变化以及Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路相关因子表达。结果 与假手术组相比,IS组神经功能评分、脑梗死率、脑水肿含量、铁离子含量显著增加,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著降低(P <0.05);与IS组相比,治疗组神经功能评分、脑梗死率、脑水肿含量、铁离子含量显著下降,Nrf2、SLC7A11、GPX4表达显著增加(P <0.05);抑制剂组逆转了治疗组对IS大鼠神经保护。结论 布洛芬可以保护IS大鼠神经受损,可能与激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路有关。