不同浓度IL-17A中和性抗体对CIA小鼠血清中炎症细胞因子表达的影响

目的通过建立胶原诱导关节炎(CIA)小鼠模型,探讨不同浓度的IL-17A中和性抗体对CIA小鼠血清中炎症细胞因子表达。方法将48只SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为4组:A(空白对照)组、B(CIA+生理盐水)组、C(CIA+高浓度)组、D(CIA+低浓度)组;采用鸡II型胶原加氟氏完全佐剂乳化制备抗原尾部多点皮下注射;初次免疫2周后以同样方法加强免疫,诱导CIA小鼠模型出现后在小鼠腹腔注射细胞因子中和性抗体或生理盐水,观察2周并记录小鼠关节及关节外表现,检测血清TNF-a、IL-17、IL-6表达水平。结果 C、D与B比较TNF-a、IL-17、IL-6表达水平显著降低,并且IL-17A中和性抗体高浓度组较低浓度组血清中炎症细胞因子表达水平降低,差异有统计学意义(<0.05)。结论 IL-17A中和性抗体可显著降低CIA小鼠模型血清中炎症细胞因子TNF-a、IL-17、IL-6表达水平,且以高浓度组较低浓度组改善骨关节功能更显著,其作用机制可能是通过调节Th17细胞参与介导的细胞因子-破骨细胞损伤免疫机制,抑制炎症细胞因子表达,进一步影响破骨细胞因子来实现。

TRAIL对CIA小鼠脾细胞表达Th1/Th2细胞因子的影响

目的观察肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠的治疗效果,探讨TRAIL治疗类风湿性关节炎(RA)的可能机制。方法牛Ⅱ型胶原蛋白加弗氏完全佐剂免疫DBA/1J小鼠建立CIA模型,采用重组腺相关病毒AAV-TRAIL关节腔内注射进行治疗。CBA和流式细胞术检测Th1/Th2细胞因子的分泌。结果 AAV-TRAIL可改善CIA小鼠的病情,减轻关节红肿。体外研究其机制发现Ⅱ型胶原可以增加Th1型细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-2和Th2型细胞因子IL-4、IL-5的分泌,其中Th1型细胞因子的增加更为明显。而TRAIL则可显著抑制Ⅱ型胶原引起的Th1型细胞因子的上调,而对Th2型细胞因子的分泌没有影响。结论 TRAIL对CIA小鼠的治疗作用可能和TRAIL抑制Th1型细胞因子分泌相关。

祖师麻乙素对CIA小鼠Th17/Treg细胞失衡的影响

目的观察祖师麻乙素(DAN)对胶原诱导型关节炎(CIA)小鼠辅助性T17细胞(Th17)/调节性T细胞(Treg)的影响,初步探讨DAN对CIA小鼠的治疗作用及其机制。方法通过胶原诱导造模法建立CIA小鼠模型。将DBA/1小鼠随机分为正常组(0.9%NaCl)、模型组(CIA模型)、阳性对照组(腹腔注射1.5 mg·kg^(-1)甲氨蝶呤)和低、中、高剂量实验组(腹腔注射2、4、8 mg·kg^(-1)DAN)。用酶联免疫吸附试验法测定血清中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量,用实时荧光定量聚合酶链反应法检测小鼠滑膜组织转录因子维A酸相关孤儿受体γt(RORγt)和叉头框蛋白p3(Foxp3)mRNA的相对表达水平,用流式细胞术检测小鼠脾Th17、Treg细胞变化。结果正常组、模型组和中、高剂量实验组和阳性对照组的血清IL-1β水平分别为(38.82±2.20)、(59.37±4.84)、(46.23±4.54)、(43.87±4.72)和(42.76±1.55)pg·mL^(-1),TNF-α水平分别为(86.22±2.48)、(106.28±9.13)、(91.74±1.50)、(89.63±1.34)和(88.51±4.75)pg·mL^(-1),Foxp3 mRNA表达水平分别为1.00±0.06、0.22±0.14、0.39±0.03、0.44±0.11和0.51±0.11,RORγt mRNA表达水平分别为1.00±0.81、5.27±4.81、1.08±0.89、1.03±0.61和1.03±0.61,Th17细胞的表达分别为1.77±0.88、10.80±1.80、5.35±0.23、4.51±0.01和4.08±0.49,Treg细胞的表达分别为4.28±0.67、1.52±0.05、2.37±0.17、3.17±0.29和3.39±0.17。模型组的上述指标与正常组比较,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05);中、高剂量实验组、阳性对照组的上述指标与模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论祖师麻乙素能缓解CIA小鼠关节肿胀,减轻CIA小鼠关节病理损伤,其机制与调节CD4+T淋巴细胞亚群Th17/Treg细胞失衡有关。

骨形态发生蛋白在胶原诱导关节炎小鼠模型中的表达

目的建立DBA/1J小鼠胶原诱导关节炎(CIA小鼠)模型,初步研究CIA小鼠外周血单个核细胞中及病变关节组织中BMPs的表达水平。方法利用牛Ⅱ型胶原诱导DBA/1J小鼠发生关节炎病理改变;利用荧光定量PCR检测发病外周血单个核细胞中及关节组织BMPs的mRNA的表达水平,利用免疫荧光技术检测关节组织中BMP9蛋白表达水平。结果成功建立了CIA小鼠模型,检测发现BMP4mRNA和BMP9mRNA在发病的CIA小鼠外周血单个核细胞及病变关节组织中表达明显下调(P<0.05),荧光免疫技术显示BMP9蛋白在CIA小鼠病变关节组织中表达明显下调(P=0.002)。结论在基因水平BMP4、9在CIA小鼠外周血单个核细胞中及病变组织中表达明显下调,蛋白水平BMP9在CIA小鼠病变组织中表达明显下调。

槲皮素对小鼠胶原诱导性关节炎症的影响

目的探讨槲皮素对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠关节炎症的影响。方法 6-7周龄的DBA/1 J小鼠随机分为4组,每组10只,对照组,模型组,甲氨喋呤组,槲皮素组。除对照组外,其余小鼠给予牛属Ⅱ型胶原+完全弗氏佐剂进行CIA小鼠第一次免疫,第21天给予牛属Ⅱ型胶原+不完全弗氏佐剂进行加强免疫,次日各组开始给药30天,观察小鼠体重、关节炎指数、足掌厚度、关节病理变化指标。结果与模型组相比,槲皮素可显著改善CIA小鼠关节炎指数、足掌肿胀,对CIA小鼠体重无明显影响,可显著改善CIA小鼠踝关节的病理表现,减轻踝关节的骨破坏。结论槲皮素可有效的减轻CIA小鼠关节滑膜炎症,减轻关节骨破坏,槲皮素是治疗类风湿性关节炎的潜在有效药物。

热休克蛋白70肽段抑制胶原诱导关节炎小鼠Th17细胞生成

目的:研究HSP70肽段对CIA小鼠Th17细胞的影响,探讨其抑制CIA小鼠炎症损伤的机制。方法:将DBA/1小鼠随机分为HSP70肽段实验组、阴性对照组、结核菌素(PPD)对照组、阳性对照组。除阴性对照组外,其它各组小鼠用牛Ⅱ型胶原蛋白诱导关节炎。通过关节评分和病理改变评价病变程度。取外周淋巴结用流式细胞仪检测Th17细胞的数量,用实时定量PCR检测Th17细胞相关调控因子。结果:注射HSP70肽段的CIA小鼠其Th17细胞数量明显低于阳性对照组和PPD对照组,促进Th17细胞分化发育的相关因子IL-6、IL-23、TGF-β1、RORγt的表达水平低于阳性对照组和PPD对照组(P<0.05)。结论:HSP70肽段可调节Th17细胞分化的调控因子,抑制Th17细胞的分化,进而减轻CIA小鼠的炎症程度。

Ubc13对胶原诱导性关节炎小鼠体内Treg/Th17平衡的影响研究

目的:研究重组泛素结合酶2N(Ubc13)蛋白对胶原诱导性关节炎(CIA)模型小鼠体内调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)平衡的影响。方法:小鼠随机分为空白对照组(空白组),CIA模型对照组(模型组),CIA+5 μg Ubc13组(低剂量组),CIA+25 μg Ubc13组(中剂量组),CIA+50 μg Ubc13组(高剂量组)。模型组与Ubc13各剂量组小鼠第0天尾根部皮下注射胶原,第21天加强免疫,建立CIA模型。第21天开始Ubc13各剂量组分别每天皮下注射Ubc13重组蛋白,模型组注射等体积生理盐水。二次免疫56 d后,剖解小鼠,取小鼠脾淋巴细胞,流式细胞术检测Treg细胞和Th17细胞数目,实时定量PCR(qRT-PCR)检测小鼠脾脏维甲酸相关受体c(RORc)、白介素23(IL-23)、叉头转录因子p3(Foxp3)和白介素17(IL-17)mRNA水平,HE染色鉴定小鼠关节病理特征。结果: Ubc13能显著提高小鼠Treg细胞在Th细胞中的比率( P <0.05),并改善关节炎症。与模型组相比,Ubc13各剂量组脾脏中IL-23、IL-17和RORγt的表达量显著降低( P <0.05),HE染色显示Ubc13各组小鼠关节损伤均显著减轻。结论:皮下注射Ubc13可通过增加CIA模型小鼠体内Treg的数量,降低Th17细胞相关基因的表达,改善CIA小鼠关节炎。

沉默转录因子YY1表达对胶原诱导的关节炎小鼠肠道菌群的影响

目的:通过干扰慢病毒探讨沉默转录因子阴阳1(YY1)表达对胶原诱导关节炎(CIA)小鼠肠道菌群的影响。方法:采用Ⅱ型胶原免疫DBA/1J小鼠构建CIA模型;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-17 mRNA相对表达量;采用16S rRNA高通量测序方法进行肠道微生物测序,测序结果采用Microbial Ecology相关软件和数据库进行分析。结果:与对照组(NC)相比,在CIA小鼠体内干扰YY1表达后,小鼠的关节炎症评分降低,外周血单个核细胞中TNF-α、IFN-γ和IL-6 mRNA相对表达量降低;反映菌群分布丰度的ACE和Chao指数无明显差异;反映菌群多样性的Shannon指数增加,Simpson指数降低;Intestinimonas和Acetobacteroides菌属含量增加;京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析显示磷酸代谢和丙二酚降解等功能有差异。结论:在CIA小鼠体内沉默YY1表达可影响其肠道菌群的多样性和分布。

IL-1β、IL-1RA、IL-33在胶原诱导关节炎的表达以及RNA干扰抑制HIF-1α对其的影响

目的了解白介素(IL)-1β,IL-33、IL-IRA在胶原诱导关节炎(CIA小鼠模型)血清中的表达情况,及短发夹RNA(shRNA)特异性干扰沉默缺氧诱导因子1(HIF-1α)对其在CIA小鼠血清及关节滑膜组织中表达的变化。方法选用20只6~8周龄SPF级DBA/雄性小鼠,分为完全对照组、CIA对照组、阴性病毒对照组和HIF-1α干扰组,应用酶联免疫吸附测定(ELASA)法检测体内转染HIF-1α减低表达慢病毒治疗前后血清中IL-1β、IL-33、IL-IRA的表达;同时应用免疫组化法观察关节滑膜组织中上述炎症因子的表达。结果 IL-1β,IL-33、HIF-1α在完全对照组及HIF-1α干扰组的小鼠血清及关节滑膜组织中低表达,CIA对照组、阴性病毒对照组高表达;IL-IRA与之相反。结论 CIA小鼠血清和关节滑膜组织中IL-1β、IL-33呈高表达,通过HIF-1α干扰抑制,可以抑制其表达。

中性粒细胞NETs介导类风湿关节炎疾病的进展研究

目的:探索下调中性粒细胞能否缓解胶原诱导关节炎(collagen induced arthritis,CIA)小鼠疾病程度,结合测序分析类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者中性粒细胞外捕获网(neutrophil extratrapping networks,NETs)形成后的转录组表达差异,为NETs影响RA疾病进展的后续研究提供一定的理论基础。方法:利用DBA1小鼠构建CIA模型,在二次胶原强化免疫后利用抗Ly6G单克隆抗体敲减CIA小鼠体内中性粒细胞(1次/周),持续干预8周后,处死小鼠采集肺、脾、小鼠后肢进行组织病理学观察;磁珠分选法收集4例RA患者外周血中性粒细胞,DAPI染料对中性粒细胞核进行染色,室温避光静置15 min后,镜下观察中性粒细胞形态特征;利用不同浓度(8 nmol/L、16 nmol/L、32 nmol/L)佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)刺激后培养2 h并进行NETs标志物染色,荧光倒置显微镜下观察刺激中性粒细胞形成NETs的最佳浓度;利用PMA激活中性粒细胞后收集样本进行转录组测序,分析RA中性粒细胞NETs形成后的转录组表达变化。结果:中性粒细胞表达下调部分缓解CIA小鼠关节滑膜、肺及脾的病理改变;8 nmol/L PMA刺激RA中性粒细胞放置2 h、37℃、5%CO_(2)培养箱中形成NETs的形态最佳;差异分析筛选出2742个差异基因(P≤0.05),其中包括1579个上调差异基因[log_(2)(RA_control/RA_PMA>0)]和1163个下调差异基因[log_(2)(RA_control/RA_PMA<0],从中筛选出340个显著差异基因(log_(2)|RA_control/RA_PMA|≥2),进行PPI网络构建进行展示;340个差异基因的GO、KEGG和GSEA KEGG通路分析分别富集较多为免疫回应和信号受体活性的调控、细胞因子之间相互调控通路、细胞因子受体互作、凋亡和Toll受体信号通路中。结论:下调中性粒细胞可缓解CIA小鼠关节滑膜、肺及脾的病理改变;RA的NETs形成与免疫调控、凋亡以及细胞因子之间相互作用通路相关,表明NETs的形成可能参与以上免疫过程,对RA疾病进展起重要的作用。

防己黄芪汤对胶原诱导性关节炎小鼠的影响

目的:观察防己黄芪汤对Ⅱ型胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠的影响。方法:6~7周龄的DBA/1J小鼠适应性喂养1周后随机分为4组造模,对照组、模型组、甲氨喋呤组、防己黄芪汤组各10只小鼠。除对照组外,其余小鼠给予牛属Ⅱ型胶原+完全弗氏佐剂进行CIA小鼠第一次免疫,第21天给予牛属Ⅱ型胶原+不完全弗氏佐剂进行加强免疫,次日各组开始给药20d,每5d观察小鼠体质量、关节炎指数、足掌厚度、受累肢体数目。结果:与模型组相比,防己黄芪汤组和甲氨蝶呤组对CIA小鼠关节炎指数、足掌肿胀有显著改善作用,差异有统计学意义(P<0.05);对CIA小鼠体质量及受累肢体数目的影响,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:防己黄芪汤对CIA小鼠的关节炎症和肿胀有显著改善作用,是治疗类风湿性关节炎的潜在有效方剂。

TIPE2在类风湿关节炎发病中的表达及其意义

目的探讨TIPE2（tumor necrosis factor—α induced protein 8 like 2）在牛Ⅱ型胶原诱导的CIA模型小鼠脾脏及类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的外周血淋巴细胞中的表达及其意义。方法使用牛Ⅱ型胶原免疫DBA-1／j小鼠，建立CIA小鼠模型；半定量RT-PCR法检测CIA小鼠脾脏中TIPE2基因的表达变化，荧光定量RT-PCR检测患者和健康对照者新鲜分离的淋巴细胞中TIPE2基因的表达差异；Westernblot检测CIA小鼠脾脏及患者淋巴细胞中TIPE2蛋白表达差异。并研究TIPE2与类风湿关节炎患者病情活动程度的关系。结果CIA小鼠的脾脏细胞中和患者外周血淋巴细胞中TIPE2在mRNA和蛋白水平表达增强，此外类风湿患者在活动期TIPE2表达更高，差异有统计学意义。类风湿关节炎患者的TIPE2表达水平和DAS28评分成明显正相关（P〈0．001）。结论TIPE2参与了类风湿关节炎的发病过程，TIPE2可能是评价类风湿关节炎患者病情严重程度的标志物。