肺炎链球菌ciaH/R基因重组表达及CiaH/R与β-内酰胺类耐药相关性

目的:构建肺炎链球菌ciaH和ciaR基因的原核表达系统,探讨CiaH和CiaR封闭后细菌耐药性变化。方法:采用PCR扩增全长ciaH和ciaR基因,以常规基因工程技术建立其原核表达系统。采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶图象分析系统检测目的重组蛋白rCiaH和rCiaR表达量。制备rCiaH和rCiaR兔抗血清及其IgG。检测IgG胞外或胞内封闭肺炎链球菌菌株CiaH和CiaR后,细菌对青霉素和头孢噻肟耐药性的变化。结果:与报道序列比较,所克隆的ciaH和ciaR基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.9%～100%和100%。所构建的工程菌E.coli BL21DE3pET42a-ciaH和E.coli BL21DE3pET42a-ciaR能高效表达目的重组蛋白rCiaH和rCiaR,其产量分别高达细菌总蛋白的33%和45%。rCiaH、rCiaR抗血清及其IgG免疫双扩散效价分别为1∶4、1∶4和1∶1、1∶1。CiaH-IgG胞外或胞内封闭CiaH、CiaR-IgG胞内封闭CiaR后,青霉素及头孢噻肟敏感菌株可出现对两种抗生素的耐药性,但对耐药菌株耐药性无明显影响。结论:成功地构建了肺炎链球菌ciaH/ciaR基因原核表达系统,为深入研究该TCS与耐药性关系奠定了基础。CiaH和CiaR均与肺炎链球菌对青霉素及头孢噻肟耐药性有关。

氟环境下变形链球菌耐氟菌株ciaH、eno和pykF基因的差异表达及其意义

目的:检测变形链球菌耐氟菌株在氟环境下ciaH、eno和pykF基因表达的差异,探讨ciaH、eno和pykF基因与变形链球菌氟抗性的关系。方法:变形链球菌亲代菌株及其耐氟菌株,分为亲代组(变形链球菌亲代菌株生长于无氟BHI培养基中)、耐氟组(耐氟菌株生长于无氟BHI培养基中)和含氟组(耐氟菌株生长于含氟量为1g·L^(-1)的BHI培养基中)。分别选取3组处于生长对数期(11h)和稳定期(20h)的菌株,采用RT-PCR法检测ciaH、eno和pykF mRNA表达水平。结果:与耐氟组比较,含氟组的耐氟菌株ciaH、eno和pykF mRNA表达水平在对数期和稳定期均明显升高(P<0.05或P<0.01);与亲代组比较,耐氟组的耐氟菌株eno和pykF mRNA表达水平在对数期和稳定期均明显降低(P<0.01),ciaH mRNA表达水平在对数期差异无统计学意义(P>0.05),在稳定期明显升高(P<0.01)。结论:氟能提高耐氟菌株ciaH、eno和pykF基因的表达,该组基因与耐氟菌株氟抗性的产生有关联。

肺炎链球菌 ciaH 基因与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性研究

目的：构建肺炎链球菌ciaH基因敲除（ΔciaH）突变株，了解肺炎链球菌二元信号系统CiaH／CiaR中ciaH基因与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性。方法采用PCR 扩增肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因片段，T-A克隆后测序。构建用于敲除ciaH基因的自杀质粒pEVP3ciaH ，CaCl2法将其转化入肺炎链球菌ATCC6306株，通过同源重组、插入失活及氯霉素筛选获得肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因敲除突变株ΔciaH。采用PCR、测序及激光共聚焦显微镜法对ΔciaH突变株进行鉴定。采用二倍琼脂稀释法测定并比较青霉素G（ PCN）或头孢噻肟（ CTX）对ΔciaH突变株和野生株最低抑菌浓度（ MIC）及其差异。采用实时荧光定量RT-PCR（ qRT-PCR）检测1／4 MIC PCN或CTX作用前后ciaH-mRNA水平变化。结果 PCR和测序结果显示，所构建的ΔciaH突变株染色体DNA中ciaH基因被插入失活；免疫荧光法检测结果显示，ΔciaH突变株不表达CiaH蛋白。 PCN和CTX对ΔciaH突变株MIC分别为32μg／ml 和64μg／ml，明显高于野生株的0．06μg／ml 和1μg／ml （ P＜0．01）。1／4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ciaH-mRNA水平显著升高（P＜0．01）。结论肺炎链球菌CiaH／CiaR二元信号系统中CiaH与其对β-内酰胺类抗生素耐药性有关。