人蛋白激酶CK23个亚基cDNA的克隆与测序

目的 :构建人蛋白激酶 CK2 α、α′和 β亚基 c DNA重组表达质粒深入进行 CK2结构与功能的研究。方法 :利用 RT- PCR、定向克隆和 DNA测序等进行本实验。结果 :通过反转录 PCR从 HL - 60细胞中获得了人蛋白激酶 CK2α、α′和β亚基编码区 c DNA,将 Nde I/H ind 双酶切的 3种 PCR产物分别与同样双酶切的表达载体 p T7- 7进行定向连接。Ca Cl2 法分别转化 DH5α获转化子 ,快速提取质粒 DNA进行电泳初筛得到阳性克隆。限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。每种 CK2亚基都各随机挑选 4个阳性克隆 ,PEG法进行纯化。采用 PE ABI的 Big Dye荧光标记的终止底物循环测序试剂盒 ,使用各种引物进行正反向 DNA测序。通过测序分别在每种 CK2 α、α′和 β亚基的 4个阳性克隆中筛选到 2个、1个和 2个含完全正确的人 CK2 α、α′和 β亚基 c DAN的重组质粒克隆 ,其余的克隆均存在 1～ 2个碱基突变。我们将这种含正确序列的重组质粒分别命名为 p TCKA、p TCKA′和 p TCKB。结论 :CK2全套 3个亚基重组质粒克隆的成功 ,将为在原核细胞中表达人 CK2α、α′和β亚基以及利用人 CK2α、α′和β c

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .

重组人CK2β亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶CK2 β亚基cDNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG诱导下表达 .表达蛋白大多数以不溶形式存在 .6L (约 10 2g)表达菌抽提得到约 2 0mg的可溶性表达产物 ,通过P11磷酸纤维素一步层析分离 ,得到 6 8mg纯化蛋白 .SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示纯化的蛋白为一分子质量2 6ku的单一蛋白带 .蛋白质印迹结果证明 :纯化的表达产物与抗人CK2 β抗体可发生特异性免疫反应 .CK2 β亚基对CK2α有激活作用 ,纯化的CK2α和β亚基在等摩尔混合时即可组成有最大生物活性的全酶 .实验结果有力地证明了克隆表达与纯化的重组蛋白是人蛋白激酶CK2 β亚基 .

小鼠蛋白激酶CK2β亚基的克隆、表达及活性测定

通过反转录PCR从NIH 3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2 β亚基编码区cDNA ;构建其表达质粒并经测序证明其编码小鼠蛋白激酶CK2 β亚基 ,但与两种已报道的小鼠CK2 β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异 ,与大鼠、猪、兔和人CK2 β亚基cDNA的编码区相应碱基序列则一致。将其在表达菌BL2 1(DE3)中诱导表达 ,出现一 2 6kDa分子量蛋白过度表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 31 7%,但大多数以不溶形式存在。Westernblot鉴定表明 :过度表达产物能与抗人CK2 β亚基抗体发生特异性免疫反应。当CK2α和 β亚基以 1:1摩尔比混合时 ,构成性的CK2全酶显示出最大活性 ,直接表明CK2 β亚基对CK2α有激活作用。这些结果有力地证明了克隆表达的重组蛋白是小鼠蛋白激酶CK2

醛缩酶A可与人蛋白激酶CK2α′亚基发生特异相互作用

通过PCR扩增构建的重组质粒pTHCKA′获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将PstⅠ NdeⅠ双酶切的PCR产物 ,连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7,构建为酵母双杂交穿梭表达质粒 (BD质粒 ) ,经DNA测序确证及转染感受态酵母菌AH10 9以排除自主激活 .从体外培养的HL 6 0细胞中提取总RNA ,采用CLONTECHSMART(switchingmechanismat 5′endofRNAtranscript)技术 ,在酵母细胞中构建HL 6 0细胞的酵母双杂交cDNA文库 ,将构建的BD质粒、文库cDNA、酵母穿梭表达质粒pGADT7 Rec ,共转染感受态酵母菌AH10 9进行酵母双杂交实验 .筛选与人蛋白激酶CK2α′相互作用蛋白 .筛选结果及一对一回复性实验显示 ,有 6种与CK2α′相互作用蛋白 ,核酸序列分析及同源性检索表明 ,其中 1种与醛缩酶A有高度同源性 (99 6 % ) .

重组小鼠CK2α亚基在大肠杆菌中的表达、纯化及活性测定

目的 研究重组小鼠CK2α亚基在大肠杆菌中的表达 ,并进行纯化和活性的测定。方法 将已构建成功的小鼠蛋白激酶CK2α亚基cDNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,产物依次进行DE 5 2、P11磷酸纤维素和肝素 Sepharose柱层析分离 ,SDS PAGE银染。结果 重组质粒转化表达菌经IPTG诱导后出现一分子量为 4 2ku蛋白过度表达 ,表达蛋白约占菌体总蛋白的 30 6 %。从2 87mg可溶性蛋白质中得到 4 7mg纯化蛋白。SDS PAGE银染显示纯化的蛋白为单一蛋白带。纯化的CK2α和 β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶。重组的CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致。

人蛋白激酶CK2α′亚基cDNA的克隆与测序

目的 构建人蛋白激酶CK 2α′亚基cDNA重组表达质粒 ,研究CK 2的结构与功能。方法 采用RT -PCR、定向克隆和DNA测序等一系列分子生物学技术进行本实验。结果 从人白血病细胞 (HL 60 )中获得了人CK 2α′亚基cDNA ,使用NdeⅠ /HindⅢ双酶切PCR产物和表达载体 pT 7-7进行定向克隆 ,限制性酶切鉴定证明重组获得成功。 4个阳性克隆DNA测序结果显示有 1个含有正确插入的人CK 2α′cDNA ,命名为 pTCKA′ ;其余 3个克隆均存在碱基突变。 结论 成功克隆到人CK 2α′亚基cDNA的重组表达质粒。

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

】目的 :构建小鼠蛋白激酶 CK2 β亚基 c DNA重组表达质粒 ,以便深入进行 CK2结构与功能的研究。方法 :通过反转录 PCR从 NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶 CK2 β亚基编码区 c DNA,PCR扩增酶为高保真 DNA聚合酶。将 N de I/ H ind 彻底双酶切 PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去 5′端磷酸的同样彻底 Nde I/ H ind 双酶切的表达载体 p T7- 7中 ,转化感受态大肠杆菌 DH5 α获得转化子 ,用 0 .8%琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子 ,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行 DNA测序。结果 :转化子的阳性筛选率为 10 0 % ,限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。 DNA测序结果表明 :两个重组小鼠 CK2 β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠 CK2 β亚基 c DNA编码区序列分别存在一个碱基差异 ,但我们报道的这 2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人 CK2 β亚基 c DNA的编码区相应碱基序列一致。结论 :本实验克隆的小鼠蛋白激酶 CK2 β亚基 c

肝癌中蛋白激酶CK_(2α)亚基的克隆及其功能初步研究

目的 克隆肝癌中CK2α基因 ,并研究其功能。方法 通过逆转录PCR从肝癌组织中获得CK2α亚基基因编码区cDNA。将NdeI/BamHI双酶切PCR产物连接到同样双酶切并经牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化的表达载体 pT7- 7进行定向克隆。转化感受态大肠杆菌DH5获得转化子 ,琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子 ,将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选 4个阳性克隆进行DNA测序 ,将序列完全正确的重组质粒转化表达菌BL2 1(DE3) ,挑单克隆小量培养 ,IPTG诱导表达 ,Westernblot鉴定。结果 转化子的阳性筛选率为 10 0 % ,限制性酶分析结果表明 ,插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符。DNA正反向测序结果表明 :从 4个阳性克隆中筛选到 1个PCR过程不产生突变的重组质粒 ,并将其质粒命名为 pTMCKA。重组质粒转化表达菌经TPTG诱导后出现一个分子量 4 2Kda蛋白过度表达 ,Westernblot结果证明过度表达产物能与抗人CK2α亚基抗体发生特异性免疫反应。结论蛋白激酶CK2α亚基在肝癌中表达 。

探讨CK2催化亚基α和α'蛋白在结直肠癌组织中表达情况及临床意义

目的:分析研讨CK2催化亚基α和α'蛋白在结直肠癌组织中表达情况和临床意义。方法:从我院2015年8月至2017年9月期间收治的结直肠癌患者中抽取54例纳入到讨论中(研究组),同时纳入同时期癌旁正常黏膜组织患者54例(对照组),用免疫组化方式测定其CK2α和α'蛋白表达状况,并分析检测结果。结果:癌组织中CK2α'和CKα炎性率分别为79.63%和83.33%,明显高于对照组12.96%和9.26%,对比两组阳性率P<0.05。结论:α'蛋白和CK2α在直肠癌中均为高表达状态,此和结直肠癌疾病发生,以及疾病发展存在密切性关系。

细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1和p27kip1在老年乳腺浸润性导管癌中的表达及临床意义

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤〔1〕,欧美国家中的老年患者(60岁以上)约占49%〔2〕。细胞在基因水平上失去对本身生长的正常调控,生长周期失调紊乱,可发生肿瘤,p27 kip1作为抑癌基因,负性调控细胞周期,表达水平与细胞增殖程度紧密关联。CKS1正性调节细胞周期,是一种癌基因,能够促进肿瘤发生,在肝癌、乳腺癌、胃癌等癌组织中表达增高〔3,4〕。

乳腺癌组织中CKS1和CyclinD1的表达及相关分析

目的:探讨细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1(cyclin kinase subunit1,CKS1)和细胞周期蛋白D1(CyclinD1)在乳腺癌组织的表达及意义。方法:采用免疫组化SP法检测105例乳腺癌组织中CKS1和CyclinD1的表达,并同时检测100例乳腺纤维腺瘤作为对照,分析其在乳腺癌组织中的表达及临床意义。结果:CKS1和CyclinD1在乳腺癌组织中的阳性率分别为80.9%(85/105)和85.7%(90/105),在乳腺纤维腺瘤中的阳性率分别为22%(22/100)和19%(19/100)。乳腺癌中两基因蛋白的阳性表达与淋巴管侵犯、淋巴结转移有关;乳腺癌中两基因蛋白的阳性表达均明显高于乳腺纤维腺瘤(P<0.05);乳腺癌组织中CKS1与CyclinD1的阳性表达呈正相关(r=0.677,P<0.05)。结论:CKS1和CyclinD1在乳腺癌组织中的表达较对照组乳腺纤维腺瘤明显升高,并且与淋巴管侵犯、淋巴结转移呈正相关,提示检测2种蛋白的表达对乳腺癌的临床治疗及预后预测具有一定的意义。

CKS1和CyclinD1在老年肝细胞癌中的表达

肝细胞癌（HCC）是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，尽管手术切除和肝移植已经显著改善小肝癌及无转移肝癌患者的生存时间，但是晚期肝癌患者的预后仍然较差。细胞周期蛋白依赖性激酶调节亚基1（CKS1）是高度保守的细胞周期调节蛋白SUCl／CKS蛋白家族成员之一，在胃癌、乳腺癌和肝癌等多种肿瘤组织中高表达。细胞周期蛋白D1（CyclinD1）在乳腺癌、结肠癌和肝癌组织中表达升高，其表达失调会导致细胞周期异常从而促进肿瘤发生。本研究分析CKS1和CyclinD1蛋白在HCC及对应癌旁组织中的表达水平及其与临床病理特征之间的相关性。

CK2α在甲状腺肿瘤中的表达及其在癌转移中的作用机制研究

目的探讨蛋白激酶CK2的催化亚基(CK2α)在甲状腺癌中的表达水平,并对CK2α在甲状腺癌中的生物学功能及内在机制进行评价。方法20对甲状腺癌组织和邻近非肿瘤组织样本来自海军军医大学第一附属医院的手术患者,并采用qRT-PCR检测CK2α在甲状腺癌组织和不同人甲状腺癌细胞株中的表达情况;采用CKK-8法检测CK2α对甲状腺癌细胞增殖能力的影响;划痕实验和Transwell法检测CK2α对甲状腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;采用qRT-PCR分析CK2α对YBX1表达调控的关系。结果CK2α在甲状腺癌组织和细胞株中表达明显上调。此外,降低CK2α表达显著抑制了甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭,相反过表达CK2α则促进了甲状腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。从机制层面上,下调CK2α表达抑制YBX1表达,从而抑制甲状腺癌细胞得生物学功能。结论CK2α通过促进YBX1表达,从而促进甲状腺癌的发生发展。