蛋白激酶CK2及其抑制剂在肿瘤多药耐药中的研究进展

肿瘤耐药性是临床上化疗失败的主要原因之一。蛋白激酶CK2是一种高度保守、具有广泛生物学活性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可磷酸化数百种底物。CK2的激活及过表达在肿瘤发生、发展及耐药过程中起到重要作用,并且CK2通过多种机制和信号通路参与耐药细胞中药物的外排、DNA损伤修复以及药物逃逸反应等,并调控耐药细胞中分子伴侣的活性。本研究主要对蛋白激酶CK2的结构功能及其在肿瘤多药耐药中的作用机制进行综述,并对CK2抑制剂在血液系统肿瘤、乳腺癌、胃癌、肺癌等多种实体瘤中的应用进行了探讨,为临床上开发新的肿瘤耐药分子标志物以及肿瘤的靶向治疗提供新的思路和治疗方案。

蛋白激酶CK2天然产物类抑制剂的定量构效关系研究

目的 构建CK2天然产物类抑制剂的定量构效关系(quantitative structure-activity relationship,QSAR)模型,揭示影响该类抑制剂活性的结构因素,为新型CK2抑制剂的开发提供理论基础和实验依据。方法 基于文献报道的115个多骨架CK2天然产物类抑制剂,采用遗传算法(genetic algorithm,GA)联合多元线性回归(multiple linear regression,MLR)方法,建立了基于优选的Dragon描述符的QSAR模型,以留一法交叉验证系数Q^(2)_(LOO)以及相关系数R^(2)作为模型内部验证的评价指标;通过Q^(2)_(ext)和R^(2)_(ext)评估模型的外部预测能力。结果 最优2D-QSAR模型由8个描述符组成,基于训练集内部验证的统计学参数为Q^(2)_(Loo)=0.7914、R^(2)=0.8220;基于测试集外部验证的统计学参数为Q^(2)_(ext)=0.792 1、R^(2)_(ext)=0.799 8,表明该模型具有较高的可靠性和预测能力。结论 影响CK2天然产物类抑制剂活性的分子描述符包括IVDE、CATS2D_08_DA、nArX、IC1、Chi_D/Dt、SdssC、F08[C-O]以及C-006。本研究可为新型CK2抗癌抑制剂的发现提供实验指导。

CK10、p16蛋白在早期宫颈癌组织中的表达及其与预后的关系

目的 分析CK10、p16蛋白在早期宫颈癌组织中的表达及其与预后关系,以期能为后期临床治疗提供指导。方法 选取首都医科大学附属北京佑安医院2015年1月至2017年1月采集的宫颈石蜡标本共200例,其中正常宫颈组织50例(A组),低级宫颈鳞状上皮内病变50例(B组),高级宫颈鳞状上皮50例(C组),早期宫颈癌50例(D组)。采用免疫组化方法检测并比较各组CK10、p16蛋白的阳性表达,分析CK10、p16蛋白表达对早期宫颈癌患者临床特征及预后的影响。结果 CK10蛋白在A、B、C、D组的阳性率分别为80.00%、66.00%、34.00%和22.00%,在早期宫颈癌中的阳性表达率最低,其次是宫颈病变,且随着病情的加重而降低。p16蛋白在A、B、C、D组的阳性率分别为10.00%、36.00%、64.00%和90.00%,在早期宫颈癌中阳性率最高,其次为宫颈病变,且随着病情的加重而增高;肿瘤中高分化、无淋巴结转移、浅层浸润间质的早期宫颈癌患者CK10蛋白阳性率较高差异有统计学意义(Z=5.279、4.781、5.383,P<0.05);肿瘤低分化、有淋巴结转移的早期宫颈癌患者p16蛋白阳性率较高(Z=4.236、5.078,P<0.05);随访5年内,CK10蛋白阴性表达患者2例因肿瘤复发死亡,阳性表达无一例死亡;p16蛋白阴性表达患者无一例死亡,阳性表达2例因肿瘤复发或转移死亡。CK10蛋白阳性表达及p16蛋白阴性表达患者的预后较佳。结论 CK10、p16的表达水平与宫颈病变程度呈负相关或正相关,肿瘤中高分化、无淋巴结转移、浅层浸润间质的早期宫颈癌患者CK10蛋白阳性率较高,预后较佳;肿瘤低分化、有淋巴结转移的早期宫颈癌患者p16蛋白阳性率较高,预后较差。

蛋白激酶CK2β、P16蛋白、人乳头瘤病毒壳蛋白联合检测诊断宫颈癌的临床价值分析

目的:探讨宫颈癌患者采用蛋白激酶CK2β、P16蛋白、人乳头瘤病毒壳蛋白(HPVL-1)联合检测的临床诊断价值。方法:选取2020年6月—2022年1月单县中心医院收治的116例宫颈癌患者作为观察组,选取同时期收治的116例宫颈瘤变患者作为对照组。患者均接受病理、蛋白激酶CK2β、P16蛋白、HPVL-1检查,将临床综合检查结果作为金标准,分析蛋白激酶CK2β、P16蛋白、HPVL-1联合检测诊断宫颈癌的价值。结果:观察组HPVL-1阳性率低于对照组,P16、蛋白激酶CK2β阳性率高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。HPVL-1、P16、蛋白激酶CK2β联合检测的灵敏度高于单一检测,漏诊率低于单一检测,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:蛋白激酶CK2β、P16蛋白、HPVL-1联合检测诊断宫颈癌,灵敏度高,漏诊率低。

缺氧胎盘组织中ROCK蛋白的表达及意义

子痫前期（pre-eclampsia, PE）是严重威胁孕产妇和胎儿健康的产科疾病，其发病机制至今未明。研究表明，PE孕妇胎盘组织中Rho相关蛋白激酶（rho associated protein kinase，ROCK）表达水平显著上调[1]，提示ROCK蛋白可能参与子痫前期的发病过程，ROCK蛋白属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员，是Rho蛋白的下游靶效应分子。ROCK蛋白具有两种亚型，即ROCKⅠ和ROCKⅡ，两种亚型的序列同源性达到64％，在激酶活性区域达到89％，两种亚型在正常及PE孕妇的胎盘组织中均有表达[2]。ROCK蛋白主要调节细胞形状以及运动、分泌、增殖、分化、凋亡等细胞功能[3]。近年来研究认为，PE发病与胎盘缺氧有关，缺氧是PE发病的关键因素，但是低氧状态下ROCK蛋白的变化及其作用目前尚不清楚。本研究通过观察低氧状态下正常孕妇胎盘组织ROCK蛋白表达的变化，进一步明确低氧对胎盘组织中ROCK蛋白表达的影响。

胃癌中Cks1、p27^(Kip1)和Skp2蛋白的表达

目的探讨Cks1在胃癌发生及其在Skp2调节p27Kip1降解过程中的作用。方法应用流式细胞术测定正常胃粘膜和胃癌组织中Cks1、p27Kip1、Skp2蛋白表达。结果胃癌组织中Cks1、Skp2表达明显高于正常胃粘膜(χ2=22.69,P<0.05;χ2=13.42,P<0.05),而p27Kip1表达则低于正常胃粘膜(χ2=14.83,P<0.05)。胃癌中Cks1、Skp2表达与p27Kip1表达呈负相关(r=-0.649,P<0.05;r=-0.732,P<0.05);而Cks1蛋白表达与Skp2蛋白缺乏相关性(P>0.05)。胃癌中Cks1的表达与肿瘤分化程度相关(χ2=5.05,P<0.05),而与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期不相关(P>0.05)。结论Cks1可能参与了胃癌的发生;胃癌中Cks1可能参与了Skp2调节p27Kip1泛素化降解过程。

重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与测序

蛋白激酶ＣＫ２是一种存在的信使非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶．它是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的不均一四聚体．用反转录ＰＣＲ从ＨＬ－６０细胞中获得了人蛋白激酶ＣＫ２β亚基编码区ｃＤＮＡ，将ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切ＰＣＲ产物连接到表达载体ｐＴ７－７的ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切位点中．转化感受态细菌ＤＨ５α获得转化子，阳性筛选率为７２％．限制性酶切分析结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符．随机挑选４个阳性质粒测定其插入片段ＤＮＡ序列，结果显示有２个含有正确插入的人蛋白激酶ＣＫ２βｃＤＮＡ，命名为ｐＴＣＫＢ．其余２个克隆分别存在１个和２个点突变，即在其编码区ｃｏｎｄｏｎ１４８的ＴＣＡ→ＴＴＡ，结果Ｓｅｒ→Ｌｅｕ；另一个则在Ｃｏｎｄｏｎ１４３ＧＴＧ→ＡＴＧ，Ｖａｌ→Ｍｅｔ；Ｃｏｎｄｏｎ１７０ＧＴＧ→ＧＣＧ，Ｖａｌ→Ａｌａ．重组质粒（ｐＴＣＫＢ）克隆的成功，将为在原核细胞中表达蛋白激酶ＣＫ２β亚基以及利用ＣＫ２βｃＤＮＡ作为探针进行深入研究打下基础．

山奈酚抑制蛋白激酶CK2活性

研究体外以及HL-60细胞内山奈酚对蛋白激酶CK2的抑制作用及机制.通过测定药物作用后转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的32P的放射性活度,探讨山奈酚对重组人CK2全酶以及细胞内CK2活性的影响;采用多重RT-PCR检测CK2α、α′和β亚基的mRNA表达水平;通过Lineweaver-Burk作图法,分析CK2的酶动力学机制.山奈酚能显著抑制重组人CK2活性(IC50=1.88μmol/L)和HL-60细胞内的CK2活性,对细胞内CK2的作用效果强于阳性对照四溴-2-氮杂苯并咪唑(TBB).山奈酚作用2h,对CK2各亚基的mRNA表达水平均没有影响.山奈酚对重组人CK2的酶动力学分析表明,山奈酚与ATP(Ki=1.14μmol/L)及酪蛋白(Ki=1.03μmol/L)均呈非竞争性抑制作用.结果提示,山奈酚是一种有效的蛋白激酶CK2的抑制剂,其作用机制可能与其阻碍CK2与ATP以及底物的结合有关.

蛋白激酶CK2在细胞周期调控中的作用

细胞周期的研究是生物生长、发育、遗传及医学等相关领域中重大问题研究的基础,其运转的分子基础是以Cyc lin-CDK-CK I为中心的细胞周期网络调控系统。蛋白激酶CK2在进化过程中是最保守的蛋白激酶之一,大量的研究表明,其在细胞周期的调控中发挥着举足轻重的作用。

人蛋白激酶CK2α′亚基在大肠杆菌中的克隆、表达及其重组蛋白的纯化与性质鉴定

通过RT PCR从HL 6 0细胞获得人蛋白激酶CK2α′亚基编码区cDNA ,将NdeⅠ HindⅢ双酶切的PCR产物和pT7 7表达载体进行定向克隆、细菌转化、电泳初筛和限制性酶切分析鉴定 .随机挑选阳性克隆进行DNA测序确证 ,筛选含与已知序列完全相符的重组质粒 (命名为pTCKA′) .将其转化BL2 1(DE3)菌 ,IPTG诱导后未见高效特异表达 .然后将人CK2α′cDNA亚克隆至GST融合蛋白表达载体 ,经同样转化和诱导步骤后可见一蛋白特异高效表达 .Western印迹结果证明 :该蛋白能与兔抗人CK2α′3 3 3 3 50 肽段抗血清发生特异性免疫反应 .采用GSH Sepharose 4B柱纯化 ,凝血酶酶切 ,最后从 4g细菌获 4 4mg纯化重组蛋白 .通过性质鉴定和酶动力学分析证明 :克隆、表达和纯化的重组蛋白是有生物学活性的人CK2α′亚基 .

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2

结直肠癌中Cks1,P27^(Kip1)和Skp2蛋白的表达

目的:探讨Cks1在结直肠癌发生及其在Skp2调节P27K ip1降解过程中的作用.方法:应用流式细胞术测定正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤和结直肠癌组织中Cks1,P27K ip1和Skp2蛋白的表达.结果:由正常结直肠黏膜、结直肠腺瘤到结直肠癌Cks1,Skp2表达呈上升趋势(P<0.05),P27K ip1表达呈下降趋势(P<0.05).结直肠癌中Cks1,Skp2表达与P27K ip1表达呈负相关(r=-0.752,P<0.05;r=-0.746,P<0.05);Cks1与Skp2呈正相关(r=0.845,P<0.05).结直肠癌中Cks1的表达与肿瘤分化程度相关(P<0.05),而与淋巴结转移及Dukes分期不相关(P>0.05).结论:Cks1可能参与了结直肠癌的发生;结直肠癌中Cks1可能参与了Skp2调节P27Kip1泛素化降解过程.

抗人乳腺癌细胞膜表面角蛋白CK8的单克隆抗体的制备及鉴定

目的:建立针对多药耐药人乳腺癌细胞膜表面差异抗原的抗体库,并鉴定抗角蛋白CK8特异性的单克隆抗体。方法:采用细胞免疫和杂交瘤技术制备单克隆抗体库,经免疫沉淀得到抗原-抗体复合物,SDS-PAGE分离目的抗原,质谱测序,Western blot验证及激光共聚焦显微镜观察抗原分子的细胞膜定位。结果:成功筛选到稳定分泌抗CK8分子的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(7F9)。结论:文中所研制的单克隆抗体具有与乳腺癌细胞膜表面CK8分子特异结合的活性,在上皮来源肿瘤标志物CK8的临床检测及CK8相关生物学活性研究中具有广泛应用前景。

LMP1-CTAR3调节CK19和vimentin蛋白在鼻咽上皮与鼻咽癌中的表达

目的观察LMP1-CTAR3调节的CK19和vimentin蛋白在鼻咽上皮和鼻咽癌中的表达,揭示蛋白质之间的相互作用规律。方法采用SP免疫组化染色检测LMP1、CTAR3、CK19和vimentin在30例鼻咽上皮组织和60例鼻咽低分化鳞状细胞癌中的表达。结果①LMP1在鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌中的阳性表达率分别为73.3%和90%;②与LMP1(-)组织比较,CK19蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌中的表达降低(P<0.05);③与LMP1(-)组织比较,vimentin蛋白在LMP1(+)的鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌的表达升高(P<0.05)。结论 LMP1-CTAR3在鼻咽上皮组织与鼻咽低分化鳞状细胞癌中下调CK19蛋白和上调vimentin蛋白的表达。

9种蒽醌类衍生物对重组人蛋白激酶CK2活性的影响及构效浅析

目的观察9种蒽醌类衍生物对重组人蛋白激酶CK2全酶活性的影响,并进行构效分析。方法将利用基因工程技术获得的重组人CK2α′及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶。通过测定药物作用后转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的32P的放射性活度,探讨蒽醌类衍生物对重组人CK2全酶活性的抑制作用,并采用半数效量概率单位法计算其IC50值。结果米托蒽醌、2-羧基蒽醌、1,2-二氨蒽醌、1,8-二羟蒽醌和醌茜能明显抑制重组人CK2全酶活性,其IC50值分别是0.66、0.81、8.81、28.76和61.26μmol·L-1;其中米托蒽醌、2-羧基蒽醌和1,2-二氨蒽醌的作用效果均强于目前已知的CK2抑制剂DRB和A3。1-氨基蒽醌和1-氯蒽醌对CK2的作用效果较弱,其IC50值分别为143.38和221.18μmol·L-1;而蒽醌和2-乙基蒽醌对CK2的活性则没有明显的影响。构效分析表明:C2上的-COOH、C8位上的-OH以及C2上的-NH2可能分别是2-羧基蒽醌、1,8-二羟蒽醌和1,2-二氨基蒽醌的药效基团;而C2上的-CH2CH3和C1上的-Cl可能分别是2-乙基蒽醌和1-氯蒽醌的非必需基团。结论米托蒽醌、2-羧基蒽醌和1,2-二氨蒽醌是3种较强的重组人蛋白激酶CK2的抑制剂。

黄色黄素抑制人白血病HL-60细胞内蛋白激酶CK2的实验研究

蛋白激酶CK2在寻找抗肿瘤及抗病毒药物方面是一个具有吸引力的分子靶点,其特异性抑制剂具有潜在的临床应用价值.通过测定药物作用后转移到CK2底物上[γ-32P]ATP的放射性活度,探讨黄色黄素对重组人CK2全酶以及细胞内CK2活性的影响;采用多重RT-PCR检测CK2α、α'和β亚基的mRNA表达水平;Lineweaver-Burk作图法分析CK2的酶动力学机制.发现黄色黄素能显著抑制重组人CK2全酶(IC50=0.86μmol/L)以及HL-60细胞内的CK2活性,其作用效果均强于阳性对照TBB.另外,黄色黄素作用2h可使CK2α和α'亚基的mRNA表达下降,对β亚基则无明显的影响.酶动力学分析表明,黄色黄素与ATP呈竞争性抑制CK2的活性,与酪蛋白则呈混合性抑制CK2的活性.研究说明,黄色黄素是一种有效的细胞内蛋白激酶CK2抑制剂.

黄芩甙对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用及其动力学分析

背景与目的蛋白激酶CK2是一种在真核细胞中普遍存在的多功能的丝/苏氨酸蛋白激酶。在许多实体瘤、白血病细胞中CK2的活性均增高。其α及α'基因是原癌基因。CK2作为一种具有潜在抗肿瘤作用的分子靶点正日益受到重视。为了寻找肿瘤细胞内CK2的特异性抑制剂,本研究观察黄芩甙体外对重组人蛋白激酶CK2的抑制效果,并进行酶动力学分析以确定其抑制作用类型。方法利用基因工程技术进行克隆、表达和纯化,获得重组人CK2的α'及β亚基并在体外等摩尔混合构成CK2全酶,测定不同条件下CK2的活性。CK2活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的32P的放射性活度来检测。结果黄芩甙能显著抑制重组人蛋白激酶CK2的活性(IC50=2.54μmol/L)。酶动力学分析表明,黄芩甙与ATP呈非竞争性抑制CK2的活性(Ki=7.73μmol/L),与酪蛋白则呈混合性抑制CK2的活性(Ki=3.07μmol/L)。结论黄芩甙是一种较强的体外蛋白激酶CK2的抑制剂。

蛋白激酶CK2β SiRNA对肺腺癌细胞A549增殖的抑制作用

目的:探讨蛋白激酶CK2B特异性小干扰RNA对肺腺癌细胞系A549生长增殖的影响。方法:构建CK2βsiRNA表达质粒稳定转染A549细胞,RT-PCR、免疫印迹、免疫细胞化学技术检测转染前后CK2β的mRNA和蛋白表达水平,同位素掺入法测定细胞内CK2活性,细胞计数法绘制细胞生长曲线,计算细胞倍增时间,流式细胞术分析细胞周期。结果:与空白组和阴性对照组相比,稳定转染pGPU6-CSNK2B质粒后,A549细胞中CK2β的mRNA水平、胞浆蛋白表达水平以及CK2活性均明显下降(P<0.05),但各组间细胞核中CK2β的蛋白表达水平无明显差异(P>0.05);A549细胞生长明显受到抑制,倍增时间增加;A549细胞阻滞于G0/G1期。结论:CK2β siRNA可以下调A549细胞中CK2β的表达及其激酶活性,并抑制细胞增殖;本研究为CK2特异性siRNA作为抗肿瘤药物的开发和CK2药靶的研究奠定了基础。

木犀草素对蛋白激酶CK2的抑制作用

目的观察体外以及细胞内木犀草素对蛋白激酶CK2活性的抑制效果及进行酶动力学分析以确定其抑制作用类型。方法将利用基因工程技术获得的重组人CK2α′及β亚基在体外等摩尔混合构成CK2全酶。通过测定药物作用后转移到CK2底物上的[γ3-2P]ATP的32P的放射性活度,探讨木犀草素对重组人CK2全酶以及HL-60细胞内CK2活性的抑制作用,并采用L ineweaver-Burk作图法分析其酶动力学机制。结果木犀草素能显著抑制重组人CK2活性(IC50=0.86μmol.L-1)以及HL-60细胞内的CK2活性,其对细胞内CK2的作用效果要强于阳性对照TBB。酶动力学分析表明,木犀草素与ATP呈竞争性抑制CK2的活性(Ki=0.19μmol.L-1),与酪蛋白则呈混合性抑制CK2的活性(Ki=0.11μmol.L-1)。结论木犀草素是一种有效的蛋白激酶CK2的抑制剂。

CKS1 siRNA对人舌癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的抑制作用

目的探讨CKS1 siRNA对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中CKS1蛋白的干扰作用。方法设计特异性CKS1插入序列,转入Tca8113细胞,应用免疫组化、RT-PCR、Western印迹检测Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达。结果 CKS1 siRNA成功导入并抑制了Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达(P<0.05)。结论 CKS1 siRNA能抑制Tca8113细胞中CKS1蛋白的表达,应用CKS1 siRNA治疗舌癌具有可行性。