ClC-3氯离子通道对高分化鼻咽癌细胞突起形成的影响

目的:探讨ClC-3氯离子通道在高分化鼻咽癌CNE-1细胞突起形成中的作用。方法:采用免疫荧光技术(Alexa Fluor 488标记抗体)检测CNE-1细胞中ClC-3蛋白的分布;MQAE荧光探针检测细胞内氯离子浓度;吸附式单通道膜片钳技术记录氯离子单通道活动;采用FAM标记的siRNA转染细胞,实验分为对照组、阴性对照(NC) siRNA组和ClC-3 siRNA组;激光共聚焦显微镜观察转染后绿色荧光情况,流式细胞术检测转染效率,Western blot法测ClC-3蛋白的表达,倒置显微镜下观察CNE-1细胞突起形成情况。结果:ClC-3蛋白主要分布于细胞膜和细胞质,且在细胞膜突起形成部位明显聚集;细胞突起处MQAE荧光弱,氯离子浓度较高,而突起根部荧光强,氯离子浓度较低;突起根部记录到翻转电位为4.06 mV的单通道电流,在-120 mV钳制电压下,该通道电导约为78.4pS;siRNA转染细胞48 h后,ClC-3 siRNA组细胞ClC-3蛋白表达量显著降低(P<0.01),且ClC-3 siRNA组细胞无片状伪足伸出,而对照组和NC siRNA组细胞伸出明显的片状伪足;此外,3组细胞均有数量不等的丝状伪足形成。结论:ClC-3影响CNE-1细胞贴壁生长时胞膜伸出突起、形成片状伪足的过程。

ClC-3反义寡核苷酸对ConA诱导的T淋巴细胞增殖的影响

目的 研究ClC 3蛋白在T淋巴细胞增殖过程中的作用。方法 采用脂质体转染技术 ,将寡核苷酸导入细胞 ,免疫印迹 (WesternBlot)方法分析ClC 3蛋白表达 ;[3H] TdR参入法观察ClC 3反义寡核苷酸对细胞增殖的作用。结果 ①ClC 3反义寡核苷酸浓度依赖性地抑制ConA诱导的ClC 3蛋白的表达 ;②ClC 3反义寡核苷酸浓度依赖性地抑制ConA诱导的T淋巴细胞增殖。结论 ClC

膀胱移行细胞癌的ClC-3和NF-κB的表达及意义

目的:探讨ClC-3和NF-κB在膀胱移行细胞癌中的表达及意义。方法:应用免疫组织化学染色技术检测31例病理诊断为膀胱移行细胞癌和6例正常膀胱组织中ClC-3和NF-κB的表达。结果:膀胱移行细胞癌组织中ClC-3主要在癌细胞的胞膜表达,阳性表达率74%(23/31)。其中膀胱移行细胞癌Ⅰ级阳性表达率40%(4/10),Ⅱ级阳性表达率81%(9/11)、Ⅲ级阳性表达率100%(10/10)。NF-κB在癌细胞的胞浆内表达,阳性表达率83%(26/31)。其中膀胱移行细胞癌Ⅰ级阳性表达率60%(6/10),Ⅱ级阳性表达率90%(10/11),Ⅲ级阳性表达率100%(10/10)。6例正常膀胱组织中仅有1例ClC-3表达弱阳性,NF-κB表达均为阴性。膀胱移行细胞癌组织中ClC-3和NF-κB阳性表达率高于正常膀胱组织(P<0.01)。结论:ClC-3和NF-κB可能与膀胱移行细胞癌病理分级和增殖有关。

刀豆蛋白A促进T淋巴细胞增殖与ClC-3蛋白的关系

目的 研究刀豆蛋白A(ConA)促进T淋巴细胞增殖与内源性ClC 3蛋白的关系。方法 免疫印迹 (Westernblot)法检测ClC 3蛋白表达 ;[3 H] TdR参入法观察ConA对细胞增殖的影响。结果 ①T淋巴细胞上有内源性ClC 3蛋白表达 ,分子量约为 80ku ;②ConA可浓度依赖性地促进T淋巴细胞增殖 ;③ConA刺激T淋巴细胞 2 4、4 8、72h后 ,ClC 3蛋白表达均增加 ;刺激 4 8h后ClC 3蛋白表达增加最多。④ConA可浓度依赖性地增加ClC 3蛋白表达。结论 T淋巴细胞上存在内源性ClC 3蛋白表达 ;ClC

ClC-3 siRNA抑制鼻咽癌细胞调节性容积回缩

目的用siRNA沉默ClC-3氯通道,探讨ClC-3氯通道在鼻咽癌CNE-2Z细胞调节性容积回缩(regulatory volumedecrease,RVD)中的作用。方法使用终浓度100 nmol/L的ClC-3 siRNA转染鼻咽癌CNE-2Z细胞,流式细胞术检测siRNA的转染率,Western blotting检测ClC-3蛋白表达,活细胞图像系统分析对照组和ClC-3 siRNA组细胞在低渗(160mOsm/L)刺激时的容积调节能力。结果 ClC-3 siRNA转染率为(63.8±3.8)%(n=3,P<0.01),与对照组相比,ClC-3氯通道蛋白的表达减少(60.9±4.0)%(n=3,P<0.01)。对照组细胞的RVD为(42.6±2.8)%(n=20),ClC-3 siRNA组细胞在低渗液中的最大容积与对照组没有显著性差异,但RVD仅为(10.5±4.8)%,RVD抑制率达75.4%(P<0.01)。结论 ClC-3 siRNA成功转染鼻咽癌CNE-2Z细胞,特异性抑制ClC-3蛋白表达,显著降低细胞RVD能力,提示ClC-3氯通道在鼻咽癌细胞调节性容积回缩中起重要作用。

氯离子通道CLC-3在乳腺癌中的表达及临床意义

目的研究氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中的表达,探讨其在乳腺癌诊断方面的临床意义及为乳腺癌发生发展方面进一步研究提供基础。方法在27例行乳腺癌改良根治术的乳腺癌患者中,分别将乳腺癌癌灶和周围正常组织用抗CLC-3抗体进行免疫组织化学染色。结果CLC-3蛋白主要表达在瘤细胞的胞浆和/或胞膜上。由于没有组间差异,应用χ2检验进行组间比较,其中乳腺癌患者21例(77.77%)阳性,6例(22.33%)阴性;乳腺正常组织中3例(11.1%%)阳性,24例(88.9%)阴性。χ2为24.3,P小于0.05,说明良恶性之间有明显差异。结论氯离子通道CLC-3在乳腺癌组织中高表达,恶性之间有明显差异。提示氯离子通道在乳腺癌发生及发展过程中有着病理生理及病理方面的临床意义,为乳腺癌的诊断及进一步研究提供临床应用基础。

沉默ClC-3氯通道基因对HeLa细胞周期分布的影响

目的:探讨沉默HeLa细胞的ClC-3氯通道基因后细胞周期分布的变化及其作用机制。方法:依照siRNA设计原则构建沉默ClC-3基因的ClC-3 siRNA并转染HeLa细胞;实验分为空白对照组(control组)、转染试剂对照组(Lipo组)、阴性对照组(negative siRNA组)和ClC-3 siRNA组。采用real-time PCR检测ClC-3 siRNA的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期分布情况;Western blot检测ClC-3蛋白及相关细胞周期蛋白(cyclin)D1、细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4、CDK6、P21和P27等表达。结果:CIC-3 siRNA成功沉默HeLa细胞的ClC-3基因。和其它组相比,ClC-3 siRNA组的细胞周期被阻抑在G_0/G_1期。CIC-3 siRNA组的cyclin D1、CDK4和CDK6蛋白表达水平明显下降,P21和P27蛋白表达水平明显上升。结论:沉默HeLa细胞ClC-3氯通道基因可影响cyclin D1、CDK4、CDK6、P21和27蛋白的表达水平胆抑HeLa细胞周期停滞在G_0/G_1期。

阻断CLC-3氯通道对结直肠癌细胞株生存率和侵袭转移能力的影响及其分子机制

目的:通过研究CLC-3在结直肠组织中的表达,探讨CLC-3对结直肠癌细胞株SW480、SW620的细胞生存率、侵袭转移能力的影响及其潜在的机制。方法:采用RT-PCR方法测定不同分期结直肠癌组织和正常结直肠组织中CLC-3的mRNA表达水平。运用CLC-3阻断剂DIDS、NPPB阻断SW480、SW620细胞的CLC-3表达后,采用CCK-8法实验检测细胞生存率,细胞侵袭实验检测细胞侵袭转移情况;并采用免疫印迹法测定阻断CLC-3表达后SW480、SW620细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达。结果:结直肠癌组织中CLC-3 mRNA表达水平高于结直肠炎黏膜组织和正常结直肠组织(P<0.05),且CLC-3 mRNA表达和结直肠分期相关。抑制CLC-3表达后,SW480、SW620细胞的生存率和侵袭转移能力降低(P<0.05),且β-catenin、C-myc、cyclin D1、Ki-67、survivin表达降低(P<0.05)。结论:CLC-3高表达与结直肠的发生发展有潜在联系,其机制可能与Wnt/β-catenin有关,为CLC-3作为治疗结直肠癌的潜在新靶点提供实验基础。

硼替佐米对多发性骨髓瘤CLC-3表达的影响

目的:研究接受硼替佐米化疗的多发性骨髓瘤(MM)患者在化疗前后CLC-3蛋白表达的变化,探讨硼替佐米对MM患者CLC-3的影响及疗效的变化。方法:流式细胞技术分离12例初发、及复发难治的多发性骨髓瘤患者的浆(瘤)细胞,检测其CLC-3蛋白表达情况。然后所有观察病例均予以硼替佐米为主的化疗方案治疗至少4(4-6)个疗程,检测其CLC-3蛋白表达的水平,了解该指标与临床疗效的关系。结果:12例MM患者治疗前的CLC-3均存在高表达。经硼替佐米为主的化疗方案治疗后,其表达水平呈下降趋势。6例完全缓解(CR)及4例非常好的部分缓解(VGPR)的患者,CLC-3表达水平恢复接近正常。结论:硼替佐米可以对多发性骨髓瘤患者的CLC-3的表达情况产生影响,CLC-3表达水平与硼替佐米疗效呈负相关性。硼替佐米直接能否下调CLC-3水平,以及氯通道可否作为治疗该病的新靶点值得进一步研究。

沉默ClC-3氯通道基因对PC-12细胞凋亡的影响

目的:观察氯离子通道蛋白3(ClC-3)基因沉默对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12凋亡的影响。方法:取处于对数生长期的PC-12细胞,随机分为4组:对照组(用正常培养基培养)、H_2O_2组(用300nmol/LH_2O_2诱导12h)、H_2O_2+空质粒组(细胞转染pGPU6/GFP24h后用H_2O_2诱导12h)、H_2O_2+siRNA组(细胞转染pGPU6/GFP-ClC-3-siRNA24h后用H_2O_2诱导12h)。通过CCK-8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,Westernblot法检测Caspase-3以及ClC-3蛋白的表达,实时荧光定量PCR检测ClC-3mRNA的表达。结果:与对照组比较,H_2O_2组、H_2O_2+空质粒组和H_2O_2+siRNA组均表现为细胞存活率下降,细胞凋亡增加,ClC-3mRNA和Caspase-3、ClC-3蛋白表达增加(P<0.05);H_2O_2组和H_2O_2+空质粒组比较,各指标差异无统计学意义(P>0.05);但与H_2O_2组、H_2O_2+空质粒组比较,H_2O_2+siRNA组细胞存活率较高,细胞凋亡率较低,ClC-3mRNA和Caspase-3、ClC-3蛋白表达较弱(P<0.05)。结论:ClC-3氯离子通道参与了H_2O_2诱导的PC-12细胞凋亡。

ClC-3氯通道蛋白磷酸化及其功能的研究进展

细胞容积调节广泛参与细胞的各种生理病理过程，如上皮细胞物质转运、物质代谢、细胞兴奋性、激素释放、细胞迁移、细胞增殖及细胞坏死凋亡等。

ClC-3氯通道对Thapsigargin触发的Ca2＋运动的影响

目的探讨ClC-3氯通道与Thapsigargin(TG)触发的Ca2+运动的关系。方法在PC12细胞中转染全长ClC-3cDNA,利用生物荧光影像分析系统测定胞质Ca2+技术探讨ClC-3氯通道对TG触发的Ca2+运动的影响。结果与对照组相比,ClC-3蛋白过表达对TG触发的PC12细胞静息[Ca2+]i的Ratio值和Ca2+释放的Ratio值无影响(P>0.05)。但使Ca2+内流量明显降低(P<0.05)。SK&F96365可以浓度依赖的抑制TG触发的Ca2+内流,但与对照细胞及空载体转染细胞相比,SK&F96365对ClC-3蛋白过表达细胞Ca2+内流的抑制作用明显减弱(P<0.05)。结论ClC-3蛋白参与TG触发的经Ca2+池操纵的Ca2+内流(store-operated Ca2+entry,SOCE)调节。

ClC-3氯通道研究进展

容积敏感性氯通道普遍存在于哺乳动物细胞 ,对维持细胞容积平衡、调节细胞电活动等多种生理功能发挥重要作用。ClC 3作为可能编码ICl.swell的基因 ,受到广泛关注。本文就近年来对ClC 3氯通道在通道特点。

CLC-3在人右心房的表达特点及与I_(Cl. vol)的相关性研究

目的通过研究CLC-3在人右心房的表达特点及影响表达的相关因素,探讨CLC-3蛋白与容量敏感的氯离子电流(ICl.vol)的关系。方法取33例心脏手术患者右心房组织,半定量RT-PCR检测CLC-3mRNA;选取可能影响CLC-3mRNA表达的相关因素如性别、年龄、是否房颤、右房横径进行多元线性回归分析;免疫组化检测CLC-3蛋白的表达,并观察CLC-3蛋白在细胞中的分布。结果RT-PCR和免疫组化均可检测到CLC-3的表达,且CLC-3蛋白分布在细胞内;多元线性回归分析提示CLC-3mRNA的表达与性别、年龄、是否房颤、右房横径没有相关性。结论CLC-3可能不是介导ICl.vol的通道蛋白。

Ca^(2+)运动对α_1-肾上腺素受体引起内源性ClC-3氯通道表达的作用

目的 研究Ca2 +运动对α1 肾上腺素受体引起ClC 3氯通道表达的作用。方法 在A10细胞上 ,用RT PCR和Westernblot检测ClC 3mRNA和蛋白质表达情况。结果 苯肾上腺素 ( 10 μmol·L-1)和thapsigargin( 0 1μmol·L-1)可促进ClC 3mRNA和蛋白质的表达 ;SK&F963 65 ( 10 μmol·L-1)和genistein( 10 μmol·L-1)可抑制苯肾上腺素引起的ClC 3的表达 ,nifedipine( 10 μmol·L-1)无此作用。结论 在A10细胞上 ,通过钙池操纵性Ca2 +通道 (SOCC)的Ca2 +内流参与了α1 肾上腺素受体引起的内源性ClC 3氯通道的表达 ,而通过电压依赖性Ca2 +通道 (VDCC)的Ca2 +内流可能与此无关。蛋白酪氨酸激酶参与了ClC

ClC-3氯通道调节氧糖剥夺所诱导的小胶质细胞的表型转化

目的 :研究ClC-3氯通道在氧糖剥夺所致小胶质细胞表型转化中的作用。方法:应用小胶质细胞株(BV-2)制备氧糖剥夺模型,分别给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB预处理BV-2细胞。通过MTT活性测定确定BV-2细胞损伤及药物的有效浓度;通过实时荧光定量PCR法测定细胞表型相关分子,如M1型相关分子[肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin 1β,IL-1β)、CD86]和M2型相关分子[转化生长因子β(transforming growth factorβ,TGF-β)、CD206]m RNA水平的表达;通过RNA干扰的方法下调ClC-3的表达,再给予氯通道阻断剂DIDS和NPPB干预,进一步检测细胞的MTT活性,观察药物作用效果。结果:预先给予DIDS(1和10μmol/L)和NPPB(1μmol/L)能够改善氧糖剥夺所诱导的BV-2细胞MTT活性下降,抑制M1型相关分子如TNF-α、IL-1β和CD86的表达并促进M2型相关分子(TGF-β和CD206)的表达;通过RNA干扰下调ClC-3的表达,能够消除DIDS和NPPB的作用。结论:ClC-3氯通道参与调控氧糖剥夺所致小胶质细胞的表型转化,阻断ClC-3氯通道抑制氧糖剥夺诱导小胶质细胞向M1型转化。

三苯氧胺(TAM)及靶向CLC-3反义核苷酸对MCF-7(ER+)增殖的影响

目的研究氯离子通道CLC-3反义核苷酸及三苯氧胺对乳腺癌MCF-7细胞株增值的影响,探讨其在乳腺癌治疗方面的生物学基础,为临床乳腺癌的内分泌治疗及生物治疗提供参考。方法将MCF-7细胞分成如下6组,对照组(control group);实验组1:CLC-3反义核苷酸;实验组2:TAM 10μM;实验组3:TAM 20μM;实验组4:CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM;实验组5:CLC-3反义核苷酸+TAM 20μM。单纯给予TAM时,于给药后24h收集细胞,以MTT比色法分析。结果随着TAM浓度从0逐渐增加到25μM,MCF-7细胞较对照组的增殖抑制率逐渐增加,呈剂量依赖性。0-10(P<0.05),10-20μM(P<0.01),单纯用反义链阻断CLC-3时MCF-7细胞的增殖没有明显受到抑制。CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM与对照组相比有差异(P<0.05);CLC-3反义核苷酸+TAM 20μM较对照组相比有明显差异(P<0.01)。CLC-3反义核苷酸+TAM 10μM与TAM 10μM对比两组之间有差异(P<0.05);CLC-3反义核苷酸+TAM20μM与TAM 20μM对比两组之间有明显差异(P<0.01)。结论 TAM有抑制乳腺癌细胞株MCF-7增殖的作用,CLC-3反义核苷酸可以增加这种作用,且随TAM的浓度增加两者之间的协同作用增大。为临床乳腺癌的内分泌治疗及生物治疗提供了参考。

ClC-3基因敲除对小鼠心室肌细胞容积敏感性Cl^-电流的影响(英文)

目的 :研究小鼠心室肌细胞容积敏感性 Cl-电流与 Cl C-3氯通道的相关性。方法 :采用基因敲除技术获得 Cl C-3基因缺失型小鼠 ;膜片钳全细胞记录法记录分离的小鼠心室肌细胞低渗诱导的容积敏感性 Cl- 电流。结果 :Cl C-3基因敲除小鼠心室肌细胞存在典型的容积敏感性 Cl-电流 ,电生理学特性表现为外向整流性、高电位刺激下的时间依赖性失活 ,以及受到 Cl- 通道阻断剂 (DIDS)的抑制。而且 ,基因敲除鼠的电流幅度与野生鼠和杂交鼠相比无明显差异 (P>0 .0 5)。结论 :Cl

氯通道ClC-3反义寡核苷酸对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响

目的研究ClC3反义寡核苷酸对H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响。方法蛋白免疫印迹法检测ClC3蛋白表达;形态学方法、DNA琼脂糖电泳、MTT法和流式细胞仪观察和分析H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变、DNA断裂、细胞存活率和凋亡率及ClC3反义寡核苷酸转染对其影响。结果ClC3反义寡核苷酸转染抑制内源性ClC3蛋白表达后,可加重H2O2诱导大鼠主动脉平滑肌细胞形态学改变及DNA断裂,细胞凋亡率由52.8%±13.6%增至75.7%±5.8%(n=6,P<0.01),而细胞存活率由48.9%±4.3%进一步降低为31.3%±4.3%(n=6,P<0.01)。结论ClC3反义寡核苷酸转染促进H2O2诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡。

血管紧张素-(1-7)通过抑制ClC-3通道减轻高糖引起的心肌细胞损伤

目的探讨血管紧张素-(1-7)[Ang-(1-7)]能否通过调控ClC-3通道保护心肌细胞对抗高糖引起的损伤。方法应用35 mmol/L葡萄糖处理H9c2心肌细胞24 h建立损伤模型。Ang-(1-7)或氯通道抑制剂与心肌细胞共处理24 h观察对高糖诱发的心肌细胞损伤的影响。应用细胞计数试剂盒8检测细胞存活率;Hoechst33258染色荧光显微镜照相术检测凋亡细胞的形态学改变;双氯荧光素染色荧光显微镜照相术测定细胞内活性氧水平;超氧化物歧化酶试剂盒测定活性;罗丹明123染色荧光显微镜照相术检测线粒体膜电位;Western blot法测定心肌细胞ClC-3通道蛋白的表达水平。结果 35 mmol/L葡萄糖处理H9c2心肌细胞24 h明显地增加ClC-3通道蛋白的表达水平(P<0.01);1μmol/LAng-(1-7)与葡萄糖共处理心肌细胞24 h显著地抑制葡萄糖对ClC-3通道蛋白表达的上调作用(P<0.01);1μmol/LAng-(1-7)或100μmol/L氯通道抑制剂氯通道抑制剂与葡萄糖共处理心肌细胞24 h减轻葡萄糖引起的损伤作用,表现为增加细胞存活率和超氧化物歧化酶活性,减小细胞凋亡数量,胞内活性氧水平及线粒体膜电位丢失(P<0.01)。结论 ClC-3通道参与葡萄糖引起的心肌细胞损伤;Ang-(1-7)通过抑制ClC-3通道保护心肌细胞对抗葡萄糖引起的损伤。