胃癌中CLIC4蛋白表达及白花蛇舌草总黄酮对其表达的影响

目的 探讨胃癌组织中CLIC4蛋白表达及白花蛇舌草总黄酮对其表达的影响。方法 乙醇回流法提取白花蛇舌草总黄酮,标准曲线法测定其含量,AB-8大孔吸附树脂进行纯化,然后作用于胃癌细胞株BGC-823,Western blot法检测CLIC4蛋白表达,同时应用免疫组化法检测95例胃癌组织中CLIC4蛋白表达。结果 95例胃癌组织中,CLIC4在肿瘤间质阳性69例,阳性率为72.6%,肿瘤实质阳性49例,阳性率为51.6%,同时阳性者23例,阳性率为24.2%。肿瘤间质CLIC4阳性率明显高于肿瘤实质阳性率（χ2=8.945,P=0.003）,肿瘤间质阳性病例主要为低分化及黏液腺癌,肿瘤实质阳性病例主要为高~中分化腺癌。随着肿瘤分化程度的降低,CLIC4间质阳性率增加。对照组胃癌细胞株BGC-823CLIC4蛋白的相对含量为0.282±0.047,实验组9.375μg/ml白花蛇舌草总黄酮作用于胃癌BGC-823细胞24h及48h,CLIC4蛋白的相对含量分别为0.205±0.022和0.164±0.032,均明显低于对照组（P=0.001,P=0.000）;实验组24hCLIC4蛋白的相对含量明显高于48h（P=0.000）。结论CLIC4可能与恶性肿瘤间质的形成有关,促进胃癌的演进;白花蛇舌草总黄酮可能通过抑制CLIC4的表达,减少恶性肿瘤间质的形成,阻止肿瘤的浸润与转移。

人胃癌组织中CLIC4基因表达与微卫星不稳定性的关系

目的探讨微卫星DNA不稳定性在胃癌发生中的作用及其与CLIC4基因表达的关系。方法采用PCR、非变性聚丙烯酰凝胶电泳及银染法检测40例胃癌组织及其相应的手术切缘正常组织中D1S234、D1S199、D1S507的微卫星不稳定性（MSI）;同时用免疫组织化学检测该40例及另外55例胃癌组织中CLIC4的表达。结果 D1S234、D1S199和D1S507阳性率分别为25%（10/40）、27.5%（11/40）和5%（2/40）。各组织病理类型之间差异无统计学意义（P〉0.05）。40例胃癌组织中,CLIC4在肿瘤实质阳性率为25%（10/40）,肿瘤间质阳性率为67.5%（27/40）,同时阳性率为15%（6/40）,同时阴性率为12.5%（5/40）。Spearman等级相关分析显示D1S199与CLIC4肿瘤实质阳性率呈正相关（r=0.137,P=0.042）,D1S507与CLIC4肿瘤间质阳性率呈负相关（r=-4.22,P=0.009）。95例胃癌组织中,CLIC4在肿瘤间质阳性率为72.6%（69/95）,肿瘤实质阳性率为51.6%（49/95）,同时阳性率为24.2%（23/95）。肿瘤间质阳性率明显高于肿瘤实质阳性率（χ^2=8.945,P=0.003）,肿瘤间质阳性病例主要为低分化及黏液腺癌,肿瘤实质阳性病例主要为高-中分化腺癌。随着肿瘤分化程度的降低,CLIC4间质阳性率增加。结论 D1S199与D1S507的MSI可能与胃癌的发生密切相关;CLIC4可能与胃癌的肿瘤间质成纤维化有关,促进了胃癌的演进。

14-3-3和CLIC4蛋白在U251细胞自噬中的相互作用

目的通过饥饿诱导神经胶质瘤U251细胞发生自噬,探讨细胞CLIC4和14-3-3蛋白在饥饿条件下诱导自噬过程中的相互作用。方法通过Hoechst、14-3-3 epsilon、CLIC4染色于共聚焦显微镜下观察抑制CLIC4表达对于饥饿条件下,14-3-3 epsilon蛋白与CLIC4共定位的影响。通过Western Blot技术检测Beclin 1及14-3-3蛋白表达。免疫共沉淀技术检测14-3-3 epsilon蛋白与CLIC4蛋白的结合水平。结果共聚焦显微镜观察14-3-3 epsilon和CLIC4荧光染色结果显示,饥饿条件下,14-3-3 epsilon蛋白与CLIC4共定位显著增加,并广泛分布于胞浆及细胞核中。同时Western Blot结果表明抑制CLIC4表达能够引起14-3-3蛋白以及自噬相关蛋白Beclin1表达增加。饥饿条件下,14-3-3 epsilon蛋白与CLIC4共沉淀增强,而抑制CLIC4表达能够降低两者结合水平。结论 14-3-3epsilon蛋白与CLIC4的相互作用由于RNA干扰而减弱,促进了14-3-3蛋白水平上调,进而增强了14-3-3蛋白对Beclin1信号通路的调节,引起Beclin1表达增加,进一步激活饥饿条件下U251细胞自噬过程。

CLIC4在饥饿诱导神经胶质瘤细胞自噬中的作用

目的通过饥饿诱导人神经胶质瘤细胞发生自噬,利用siRNA技术部分沉默细胞内氯通道蛋白4(CLIC4),探讨CLIC4在细胞自噬中的作用。方法根据CLIC4的基因序列构建CLIC4siRNA质粒,建立稳定转染CLIC4siRNA的U251细胞株,分析CLIC4蛋白表达;MTT法检测转染pSH1Si-CLIC4对细胞生存率的影响;利用Western Blot检测转染CLIC4siRNA在U251细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达;检测饥饿条件下U251细胞LC3蛋白、Bax、Bcl-2的表达;检测抑制CLIC4表达对于饥饿条件下细胞白caspase-3和胞浆cytc以及LC3的表达。结果 Western Blot显示,与空质粒对照组相比,转染CLIC4siRNA的U251细胞CLIC4表达显著下降;与对照组相比,转染空质粒细胞组以及瞬时转染pSH1Si-CLIC4载体细胞组U251细胞生存率均无明显差异;单纯CLIC4siRNA对于U251细胞Bax、Bcl-2表达无影响;与对照组相比,饥饿8h能够诱导U251细胞自噬,LC3水平显著增加,而细胞Bax、Bcl-2表达无明显变化;转染CLIC4siRNA后饥饿8h,caspase-3、cytc以及LC3表达增加。结论单纯CLIC4siRNA对于U251细胞自噬和凋亡均无显著影响,饥饿条件下U251细胞发生自噬的同时并没有明显细胞凋亡过程,抑制CLIC4表达促进了饥饿条件下的U251细胞自噬,同时能够启动线粒体相关途径的细胞凋亡。

RNA干扰沉默CLIC4基因对胃癌细胞增殖和侵袭的影响

目的探讨氯离子胞内通道(CLIC)4对胃癌细胞增殖和侵袭的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测人胃癌细胞SGC-7901和MGC-803中CLIC4的表达。应用Lipofectamine2000将CLIC4 siRNA转染到SGC-7901细胞和MGC-803细胞中,分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组、siRNA5组、模拟组(Mock组)和阴性对照组(CTRL组)。转染后,用RT-PCR技术检测CLIC4 mRNA表达水平,Western印迹检测蛋白表达水平。后续选择CLIC4 siRNA3用于后续的体外试验。使用四甲基偶氮噻蓝(MTT)比色法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。采用聚碳酸酯膜细胞培养插入皿和基质凝胶法检测两种细胞系的入侵和迁移变化。结果CLIC4 siRNA3能显著抑制CLIC4蛋白和mRNA的表达(P<0.05)。转染CLIC4 siRNA3的细胞增殖显著,G2/M期比例增加,G0/G1期和S期比例下降(P<0.05)。CLIC4 siRNA3组细胞凋亡率显著低于Mock组和CTRL组(P<0.05)。CLIC4敲低抑制胃癌细胞的体外迁移和侵袭。但Mock组和CTRL组细胞无显著性差异(P>0.05)。结论高表达的CLIC4可有效抑制胃癌细胞的增殖,促进胃癌细胞的凋亡、迁移和侵袭。

大鼠大脑局部脑缺血周围区海马及大脑皮质CLIC4及14-3-3gamma蛋白的表达及其意义

目的探讨局灶性脑缺血模型中,海马和大脑皮质14-3-3gamma和线粒体氯通道(CLIC4)蛋白的表达。方法通过大脑中动脉阻塞(MCAO)法,应用病理形态学染色发现海马和大脑皮质表现出局灶性脑缺血。应用TTC染色显示大脑缺血区面积。通过Western印迹检测Bax蛋白表达。结果脑缺血周围区海马及大脑皮质组织14-3-3gamma蛋白在神经元细胞质及细胞核呈阳性表达。对照组可见海马及大脑皮质组织CLIC4蛋白在细胞核阳性表达,缺血组可见脑缺血周围区海马及大脑皮质CLIC4蛋白在神经元细胞质呈阳性表达,Bax蛋白表达上调。结论 14-3-3gamma和CLIC4蛋白在脑缺血周围区发挥保护神经元作用。

氙气对脑白质损伤新生大鼠脑组织CLIC4 mRNA表达的影响

目的探讨早产儿脑白质损伤(WMD)的发病机制及氙气的神经保护作用机制。方法将3日龄SD新生大鼠96只按照出生时间编号后采用随机数字表法随机分为空白对照组(24只)、WMD对照组(24只)、氙气干预A组(24只)和氙气干预B组(24只)。WMD对照组及氙气干预2组予腹腔注射脂多糖(LPS)0.05mg/kg,并结扎右侧颈总动脉联合缺氧1h处理,建立WMD新生大鼠模型;空白对照组仅腹腔注射9g/L盐水(0.05mg/kg),不给予颈动脉结扎和缺氧处理。氙气干预A组和B组分别在模型建立后0、2h予500mL/L氙气吸入处理3h。各组分别于干预处理后0、24、48、72h采用随机数字表法随机各选取6只大鼠进行断头取脑,给予HE染色,髓鞘碱性蛋白(MBP)免疫荧光染色,实时定量聚合酶链反应检测脑组织中CLIC4mRNA的表达水平。结果1.脑组织病理:与空白对照组比较,WMD对照组右侧脑白质结构疏松、紊乱,可见核固缩、胞质疏松等改变;氙气干预2组也均可见上述表现,但较WMD对照组明显减轻,A、B2组间无明显差异。2.MBP测定:WMD对照组右侧脑白质MBP阳性细胞数量较空白对照组明显减少,但氙气干预2组MBP阳性细胞数量较WMD对照组明显增加。3.CLIC4mRNA表达水平:除了氙气干预A组的24h外,WMD对照组及氙气干预A组和B组右侧脑白质CLIC4mRNA的表达水平在其余时间点均高于空白对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05);但与WMD对照组相比,氙气干预A组与B组在各时间点CLIC4mRNA的表达水平均明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05);氙气干预A组与B组脑组织中CLIC4mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论WMD新生大鼠脑白质CLIC4mRNA表达水平明显升高,表明线粒体途径是WMD的病理过程之一;氙气早期干预可通过降低CLIC4mRNA的表达,减轻WMD,从而发挥神经保护作用。

Ac-SDKP对胞内氯离子通道蛋白4抑制矽肺大鼠纤维化的调节作用

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸(Ac-SDKP)对肺成纤维细胞分化过程中胞内氯离子通道蛋白4(CLIC4)表达的影响。方法非暴露式支气管内灌注法制作大鼠矽肺模型,分为对照4周组、矽肺4周组、对照8周组、矽肺8周组、Ac-SDKP抗纤维化治疗组和Ac-SDKP预防治疗组,免疫组化法、Western blot法检测Ⅰ型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及CLIC4蛋白的表达。培养新生大鼠肺成纤维细胞,观察转化生长因子(TGF)-β1诱导肺成纤维细胞后Ⅰ型胶原、α-SMA、CLIC4蛋白表达变化,同时观察给予Ac-SDKP、Smad2/3特异性抑制剂LY364947、Rock-1特异性抑制剂Y-27632、ERK1/2特异性抑制剂PD98059、JNK特异性抑制剂SP600125和P38特异性抑制剂SB203580干预后对Ⅰ型胶原、α-SMA、CLIC4蛋白的影响。结果免疫组织化学染色结果显示矽肺大鼠矽结节内可见CLIC4阳性表达,给予Ac-SDKP抗纤维化治疗或预防治疗均能够抑制Ⅰ型胶原、α-SMA及CLIC4蛋白表达的上调。TGF-β1诱导肺成纤维细胞后CLIC4蛋白表达上调,而给予Ac-SDKP、LY364947、Y-27632或PD98059预处理均能够抑制该变化,SP600125和SB203580预处理后则无改变。结论 Ac-SDKP可能通过作用于TGF-β1介导的CLIC4激活途径,从而发挥抗矽肺纤维化的作用。