大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养与CM-DiI荧光标记

背景:目前,对骨髓间充质干细胞的分离、纯化和扩增还没有统一的、标准化的方法。CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。目的:建立SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及标记的方法。方法:取2只体质量50-100 g雄性SD大鼠,无菌条件下采集双侧股骨、胫骨骨髓,用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法培养出原代骨髓间充质干细胞,通过及时、反复传代对细胞进行扩增纯化,在体外用荧光活性染料CM-DiI标记第3代骨髓间充质干细胞后作为供体细胞来源。结果与结论:用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法两种方法均能成功体外分离培养骨髓间充质干细胞,经流式细胞仪分析,培养出的细胞CD34阳性率为17.5%,CD44阳性率为97.9%、CD90阳性率为91%,与骨髓间充质干细胞表面抗原一致。但培养出的细胞数量全骨髓贴壁分离法明显多于密度梯度离心法,两种方法培养骨髓间充质干细胞的细胞活力和增殖能力无明显差异。CM-DiI能够成功荧光标记骨髓间充质干细胞,CM-DiI作为荧光标记物稳定、可靠、标记率高、标记简便。

CM-DiI标记人骨髓间充质干细胞并检测其移植后产生脑源性神经营养因子的实验研究

目的观察荧光染料(CM-Di I)标记人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSC)后,是否会脱落造成周围细胞被污染,标记细胞经静脉移植入脑梗死大鼠后是否会造成宿主脑内神经元被误染色;以及是否可以鉴定人BMMSC产生脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)。方法应用不同浓度CM-Di I分别标记培养的人BMMSC,观察标记效率。将转染绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的人胚肾293T细胞和CM-Di I标记的人BM-MSC细胞共培养,7 d之后观察CM-Di I的红色荧光和293T细胞是否双标记。将CM-Di I标记的人BM-MSC经静脉移植入脑梗死大鼠体内,观察植入细胞的红色荧光是否会沾染宿主细胞以及和BDNF免疫荧光的双标记。结果不同浓度CM-Di I(1 000、200、100、20 nmol/L)均可成功标记人BM-MSC,其中1 000、200 nmol/L浓度标记24 h后观察标记效率均达到98%以上,比100、20 nmol/L标记的效率明显升高(P<0.01)。CM-Di I标记后的人BM-MSC与GFP标记的293T细胞共培养,7 d之内没有发现红色荧光沾染绿色的293T细胞。移植后第3天,静脉植入脑梗死大鼠的标记细胞的红色荧光没有沾染宿主脑内神经元,而且可以和BDNF的绿色荧光形成双标记。结论 CM-Di I可以高效地标记人BM-MSC。采用200 nmol/L浓度标记的人BM-MSC细胞在体外培养和移植入脑梗死大鼠后都未发现对周围细胞造成污染,植入细胞的CM-Di I荧光可以鉴定产生BDNF的人BM-MSC。

CM-DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外体内的示踪观察

目的建立骨髓间充质干细胞(BMSCs)的一个简单、有效的标记和示踪方法并对BMSCs移植治疗心肌梗死作初步观察,为进一步的研究提供依据。方法应用CM-DiI细胞标记液标记第三代大鼠BMSCs,应用荧光显微镜对标记的细胞进行体外示踪观察;8只SD大鼠,制作急性心肌梗死模型,将已标记CM-DiI的BMSCs经心肌注射途径移植给急性心肌梗死模型大鼠,在移植后1周、2周、3周、4周分别取心肌组织行冰冻切片,并在荧光显微镜下观察移植细胞;于移植后4周应用免疫组织化学法检测移植细胞心肌缝隙连接蛋白43(connexin43)的表达。结果CM-DiI标记大鼠BMSCs效率达100,标记后BMSCs生长和增殖特性未受影响,形态无改变,经过传代培养14d仍然保持较清晰的红色荧光。已标记细胞在大鼠心梗模型心肌内移植后1周、2周、3周、4周,心肌组织冰冻切片可找到移植细胞,CM-DiI与BMSCs结合稳定,荧光标记效果维持一个月无明显衰退,免疫组化切片显示移植细胞少量表达connexin43。结论CM-DiI细胞标记液标记BMSCs,对细胞生长特性无影响,操作简单,标记效果好,BMSCs移植到梗死心肌4周后仍存活,并少量表达心肌特异性蛋白connexin43。CM-DiI标记细胞法可用于进一步的BMSCs移植治疗心肌梗死的研究。

CM-DiI应用于标记大鼠牙髓干细胞的实验研究

目的探讨荧光染料CM-DiI用于标记大鼠牙髓干细胞可行性。方法酶解组织块法体外分离培养SD大鼠牙髓细胞,有限稀释法对所培养的牙髓细胞进行纯化,获得呈克隆集落式生长的干细胞,免疫组化法鉴定培养细胞种属来源,成脂/成骨诱导液诱导细胞向脂肪、骨细胞方向分化。荧光染料CM-DiI体外标记第3代大鼠牙髓干细胞,观察标记后细胞增殖情况以及细胞乳酸脱氢酶释放率,统计学分析CM-DiI标记与未标记细胞的生物学状态。结果利用酶解组织块法可培养出大鼠牙髓细胞,经有限稀释法纯化后可获得克隆集落状生长的大鼠牙髓干细胞;免疫组化法确定大鼠牙髓细胞为间充质来源,且具有向脂肪细胞、骨细胞等多向分化的潜能。CM-DiI标记后的大鼠牙髓干细胞的胞浆、胞膜呈现红色荧光,并且细胞生长为梭形、生长状况良好。与未进行细胞标记组比较,CM-DiI标记后细胞形态、上清液乳酸脱氢酶含量及CCK-8值均无明显变化,两者差异无统计学意义(P>0.05)。结论 CM-DiI可用于标记大鼠牙髓干细胞,此种标记方法操作简便、染色速度快,对所标记的细胞无毒性。

CM-DiI体外标记人乳牙牙髓干细胞的可行性研究

目的:筛选CM-DiI用于人乳牙牙髓干细胞标记的最佳浓度,并对标记后细胞的生物学行为进行评价,为下一步细胞活体移植和体内示踪打下基础。方法:酶解组织块法培养人乳牙牙髓细胞并纯化,免疫组化鉴定细胞来源,进行细胞体外多向诱导分化能力实验。将第3代细胞分别使用浓度2mg/L、3mg/L及4mg/L的CM-DiI进行标记,比较标记后细胞乳酸脱氢酶释放率及细胞增殖情况,并观察经体外多次传代后细胞荧光的表达情况。结果:酶解组织块法可获得成集落状生长的人乳牙牙髓细胞;免疫组化确定细胞为间充质而非造血来源;细胞具有成脂、成骨及成牙本质等多向分化能力。3种标记物浓度均未对细胞乳酸脱氢酶释放及细胞增殖产生显著的不利影响;随体外多次传代,标记荧光强度逐渐减退。结论:CM-DiI操作简便、染色速度快,可有效的标记人乳牙牙髓干细胞,其中3mg/L的标记浓度细胞毒性极小,标记效率高,在体外多次传代后荧光信号仍能稳定表达。

CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞可行性分析

采用荧光染料CM-DiI标记兔外周血平滑肌祖细胞(SPC),评价其生物可行性.分离和培养SPC,采用CMDiI进行标记,通过荧光显微镜和流式细胞仪检测标记效果和传代后的细胞标记率.同时,进行细胞爬片培养后免疫荧光染色,观察标记后细胞表达平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、钙调节蛋白(Calponin)和增殖细胞核抗原(PCNA)的情况.进行台盼蓝排斥实验、细胞粘附实验、细胞增殖实验和细胞迁移实验,观察标记后的SPC存活率以及粘附、增殖和迁移能力的变化.结果发现,培养4d左右可见SPC开始生长,一周后出现SPC克隆.通过免疫荧光和流式细胞术分析,CM-DiI标记率为96%左右,连续传代2周后标记率仍在40%以上.标记后的细胞可表达α-SMA、Calponin和PCNA.同时发现,标记后的细胞存活率无明显降低,细胞粘附能力、增殖能力和迁移能力无明显改变.本研究证明采用CM-DiI标记SPC操作简便,效果好,不改变细胞表型,不影响细胞的存活率和粘附、增殖及迁移能力,可作为SPC的荧光示踪剂.

体内构建组织工程骨的示踪观察:CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性研究

目的探索组织工程骨体内成骨时,CM-DiI长效示踪骨髓间充质干细胞的可行性,为种子细胞的体内转归研究提供标记方法。方法分离比格犬BMSCs,成骨诱导至第2代,用荧光染料CM-DiI进行细胞标记。荧光倒置显微镜观察标记后的细胞形态,MTT比色法测定标记前后BMSCs的增殖状况,检测标记前后Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、骨形态发生蛋白(BMP-2)、骨钙素(BGLAP)和骨黏连蛋白(SPARC)的表达。最后,CM-DiI荧光标记后的BMSCs与β-TCP复合共培养后植入比格犬背部皮下,8周后取材,荧光显微镜下观察BMSCs体内转归,HE染色观察异位成骨情况。结果CM-DiI标记后早期细胞呈现红色荧光,48 h后荧光增强,72 h内荧光强度无明显减弱。BMSCs在CM-DiI标记前后细胞形态基本一致,两组间细胞的增殖率无明显差别;标记后RT-PCR检测Col-Ⅰ、BMP-2、BGLAP、SPARC表达,显示标记后的BMSCs亦可向成骨方向分化。扫描电镜检测到标记后细胞在β-TCP上增殖良好,细胞基质分泌丰富。细胞-支架复合物植入比格犬皮下,8周后荧光显微镜观察到标记细胞仍存在,且HE染色可见支架孔隙中有类骨基质沉积。结论CM-DiI对BMSCs的生长增殖、成骨分化无明显影响,对体内组织工程骨中BMSCs的示踪时间可长达8周,可用作体内细胞的长效示踪剂。

CM-DiI示踪人脐血源基质细胞体内迁移定位的研究

目的:课题组前期实验发现人脐血源基质细胞(hUCBDSC)体外具有促进造血细胞集落扩增的能力,文中拟采用CM-DiI荧光标记技术,观察hUCBDSC移植后的归巢、定位和增殖情况。方法:传代培养hUCBDSC,CM-DiI荧光染料预染后经尾静脉输入BALB/c-nu/nu裸鼠体内,分别于移植后1、7、14、21 d取裸鼠骨髓、脾脏、肝脏、肺脏组织,激光共聚焦显微镜观察CM-DiI标记hUCBDSC体内分布情况。结果:传代培养hUCBDSC呈成纤维样,CM-DiI染色后胞膜呈红色。经尾静脉移植至裸鼠体内,移植后1 d,hUCBDSC广泛分布在骨髓、脾脏、肝脏、肺脏等组织中,移植7 d以后,hUCBDSC主要分布在骨髓,在骨髓中增殖、分化;脾脏、肝脏、肺脏等组织中的hUCBDSC明显减少。结论:人脐血源基质细胞经尾静脉输注可"归巢"至骨髓,并在骨髓中增殖、分化,重建受损造血微环境。

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养及CM-DiI标记的实验研究

目的建立骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离纯化、扩增以及标记的方法,为后期体内实验提供依据。方法采用全骨髓培养和差速贴壁法分离纯化MSCs,培养期间观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞周期和表面标记物,成脂成骨分化诱导鉴定。MSCs经氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-DiI)标记后,荧光显微镜观察荧光标记情况,流式细胞仪检测标记率,并通过绘制生长曲线明确CM-DiI对MSCs生长增殖的影响。结果 MSCs接种24～48 h后,贴壁细胞多为圆形、多角形、梭形,传至第3代时形态呈均一的长梭形。第3代MSCs高表达CD44,低表达CD106,不表达CD11b、CD45,85%以上细胞处于G0/G1期;成脂成骨诱导分别经油红O和茜素红染色均呈阳性。CM-DiI标记后荧光显微镜下细胞呈红色荧光,体外培养2周荧光未见明显减弱;流式细胞术检测显示标记率达95%以上,标记后细胞生长增殖不受影响。结论通过全骨髓贴壁法及其扩增后可获得大量纯度较高的间充质干细胞,CM-DiI标记是一种简单、稳定、无毒的细胞标记方法。

CM-DiI标记的BMSCs在实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的体内示踪分布

目的观察并探讨CM-DiI标记骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植到实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠体内的示踪分布。方法全骨髓培养法分离培养大鼠BMSCs;用CM-DiI荧光染料进行体外标记;将标记后的BMSCs移植到EAE大鼠体内,观察移植后细胞的形态及分布。结果荧光显微镜下可在移植BMSCs的EAE大鼠大脑、小脑和脊髓切片内检测到发出红色荧光的细胞,疾病高峰期数量较多,主要位于软膜下和血管周围,形状为圆形或椭圆形;疾病缓解期大部分细胞仍存在,荧光强度略有减弱。结论CM-DiI是一种短中期标记、示踪BMSCs的良好染料,CM-DiI标记的BMSCs在EAE大鼠体内主要分布在血管周围,少量向脑实质内迁移。

大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养及CM-DiI标记后的传代示踪

目的建立大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)体外分离培养和细胞标记的方法,探讨CM-Di I标记ADSCs在体外传代示踪的可行性。方法无菌切取SD大鼠腹股沟脂肪组织,运用酶原消化并差速贴壁的方法获取原代细胞并进行传代培养。观察细胞形态,对第3代ADSCs进行细胞表型鉴定和成骨成脂分化能力鉴定。采用CM-Di I标记第3代ADSCs并进行传代培养,荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察荧光标记情况,流式细胞仪检测标记率。结果 ADSCs呈长梭形、漩涡样生长,传代后细胞生长增殖速度加快。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD90阳性表达,CD34、CD45、CD31阴性表达。茜素红和油红O染色显示ADSCs具有成骨成脂分化潜能。CM-Di I标记的红色荧光存在于细胞膜和细胞质,不存在于细胞核,传代培养后荧光有所衰减,第3、6、9代的荧光标记率分别为97.09%、66.21%和37.86%。结论大鼠ADSCs的生长增殖能力强,具有多向分化潜能,采用CM-Di I标记ADSCs简单易行且示踪效果良好,可为后期体内实验提供依据。

荧光染料CM—DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外实验

目的探讨荧光染料CM—DiI标记大鼠骨髓间充质干细胞的效果及其对细胞活力、增殖能力、凋亡等生物学特性的影响。方法用梯度离心加贴壁培养法获取、培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞。取第4代MSCs，分为实验组和对照组，用浓度为6μmol／L的CM—DiI对实验组MSCs进行标记。用台盼蓝染色检测细胞的活力，CCK-8法检测细胞增殖能力，Hoechst33258染色法检测细胞凋亡。细胞标记后用倒置相差荧光显微镜动态观察不同子代MSCs的阳性标记率、荧光衰减情况及细胞生长、形态变化。结果CM—DiI标记后的MSCs发橙红色荧光，高倍镜下显示细胞上有密集排列明亮荧光颗粒。CM—DiI标记后1d、4d、8d、16d、24d细胞标记阳性率分别为100％、（85．2±4．9）％、（42．3±5．1）％、（17．6±3．6）％、（4．4±1．3）％，细胞标记阳性率和荧光强度随传代次数和培养时间的增加而呈显著进行性下降。标记细胞的大小、形态、活力、增殖能力、细胞凋亡与未标记细胞相比无明显差异。结论CM—DiI标记骨髓间充质干细胞简便、有效，对其生物学特性无明显影响，可用于MSCs的短期示踪。

CM-DiI标记在小鼠骨骼肌卫星细胞移植治疗心肌梗死中的示踪研究

目的探讨 CM-DiI 标记小鼠骨骼肌卫星细胞后移植治疗心肌梗死的体外体内示踪作用。方法 CM-DiI 标记提纯后小鼠骨骼肌卫星细胞,检测标记率及荧光情况,观察 CM-DiI 对细胞增殖分化的影响。小鼠心梗模型心肌内注射标记后的卫星细胞,于移植后 1、3、7、14、21、28 天取出心脏行冰冻切片,观察移植细胞在体存活分化情况。结果 CM-DiI 标记骨骼肌卫星细胞效率达 (93.3±0.95)%,3 代后仍保持红色荧光,对细胞增殖及分化无明显影响。标记细胞移植 1 天后即可见细胞团聚,3 天后细胞排列整齐,4 周后仍可见移植细胞。结论 CM-DiI 细胞标记液标记骨骼肌卫星细胞,安全简单,并可示踪移植后细胞的存活分化情况。

骨髓间充质干细胞移植治疗大鼠急性肝衰竭

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)治疗大鼠急性肝衰竭(ALF)的机制,并示踪MSCs在ALF大鼠体内的分布、迁移。方法①以流式细胞仪检测hrGFP慢病毒感染的UE7T-13细胞株(hrGFP-MSCs)和氯甲基苯甲酰氨(CM-DiI)标记MSCs(MSCs-DiI)的绿色荧光蛋白阳性表达率或红色荧光染料标记阳性率。②CCK-8体外检测MSCs、hrGFP-MSCs和MSCs-DiI的细胞增殖情况。③取SD大鼠38只,建立急性肝损伤模型,30只造模成功,随机分为3组:CCL4组(A组)、CCL4/hrGFP-MSCs组(B组)和CCL4/MSCs-DiI组(C组)。B组和C组造模12 h肝内注射MSCs悬液。④分别于造模24 h、72 h、7天取肝组织以及肺组织观察移植hrGFP-MSCs、MSCs-DiI分布、迁移情况。造模后72 h,检测血清IL-10,TNF-α炎症因子水平,另取肝组织行PCNA免疫组化染色。结果①hrGFP-MSCs的hrGFP表达阳性率达99.21%,MSCs-DiI的CM-DiI标记率为99.98%。②CCK8检测示MSC-DiI、hrGFP慢病毒标记MSCs均不影响其增殖能力。③冰冻切片示CM-DiI标记MSCs可更好地示踪移植细胞,造模24 h、72 h及7天非注射部位肝组织和肺组织MSCs-DiI均可见散在的移植细胞团,而hrGFP-MSCs未见明确荧光阳性细胞。④MSCs治疗ALF大鼠模型下调了系统性炎症应答,造模72 h A组的TNF-α、IL-10水平大于B组及C组;PCNA示MSCs治疗促进了宿主肝细胞增殖。结论 CM-DiI标记MSCs能更好地示踪少量散在的移植细胞。异种移植MSCs可通过下调系统性炎症应答,促进肝细胞增殖,修复ALF大鼠肝组织。

骨髓间充质干细胞两种示踪方法的优缺点比较

【目的】探讨荧光染料CM-DiI直接标记和慢病毒感染法EGFP标记人骨髓间充质干细胞(hMSC)用于体内示踪的优缺点。【方法】利用FUGW质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体,并感染P3代hMSC,荧光倒置显微镜下观察细胞的感染效果及传代前后细胞EGFP表达情况的变化;CM-DiI直接标记P3代hMSC,观察CM-DiI标记对细胞生物学特性的影响及传代前后细胞标记效果的变化。分别将CM-DiI和EGFP标记的P3代hMSC移植入新生大鼠左侧脑室,2周后取大鼠脑组织行冰冻切片,比较两种标记方法用于体内示踪的效果。【结果】慢病毒感染hMSC 48h后,约40%细胞表达绿色荧光,体外培养1个月,EGFP阳性细胞数增至50%左右,荧光强度基本保持不变,细胞生长不受病毒转染的影响。CM-DiI标记hMSC 12h后,95%以上细胞呈现很强的红色荧光,1个月后,阳性细胞减少至50%左右,荧光强度也有一定程度降低,未见染料对细胞形态和生长产生明显影响。CM-DiI标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片可以找到红色荧光的标记细胞,EGFP标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片未找到绿色荧光细胞。【结论】CM-DiI和EGFP均可在体外高效标记hMSC,但CM-DiI标记的hMSC体内示踪效果优于EGFP标记。

氯甲基苯甲酰氨荧光染料用于羊骨髓基质干细胞标记和心肌内示踪动物实验

目的探讨氯甲基苯甲酰氨荧光染料(CM-Di I)标记羊骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)进行心肌内移植示踪的可行性。方法羊BMSCs经CM-Di I标记后(D-BMSCs),体外传代培养观察荧光变化;D-BMSCs细胞悬液经心肌内直接注射于心梗区和梗死移行区,观察示踪有效性。结果 CM-Di I可高效标记羊BMSCs。D-BMSCs在荧光显微镜下呈橙红色。体外培养证实D-BMSCs保持骨髓基质干细胞特异细胞形态,并在传2代后仍保持较强荧光。流式细胞术分析表明D-BMSCs与BMSCs增殖能力没有差异;三系分化证实D-BMSCs与BMSCs分化潜能相当。心肌内植入1周,D-BMSCs在荧光显微镜下发红色荧光,清晰显示其在心脏中的位置和细胞形态。结论 CM-Di I可用于羊BMSCs标记和心肌内移植示踪。

不同细胞标记物对大鼠牙髓干细胞体外标记的生物学影响

目的通过体外实验,对比氯甲基苯甲酰氨(CM-DiI)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)这两种不同细胞标记物对大鼠牙髓干细胞生物学性能的影响,为需要进行细胞标记的实验研究提供理论参考依据。方法采用酶解组织块法培养大鼠牙髓细胞并对其进行纯化,通过免疫组化鉴定细胞来源,并进行细胞体外多向诱导分化能力实验。利用5μg/ml浓度的CM-DiI和DAPI对第3代大鼠牙髓干细胞进行体外标记,通过比较细胞增殖情况以及细胞乳酸脱氢酶释放率,评价标记后细胞生物学状态。结果利用酶解组织块法可获得克隆集落状生长的大鼠牙髓细胞。免疫组化法确定细胞为间充质来源,且具有向脂肪细胞、成骨细胞以及成牙本质细胞分化的潜能。CM-DiI标记后细胞膜及核膜均呈现出红色荧光,DAPI则细胞核蓝染。与未进行细胞标记比较,CM-DiI和DAPI标记后细胞形态、上清液乳酸脱氢酶含量及CCK-8值均无明显变化,两组差异无统计学意义。结论CM-DiI和DAPI操作简便、染色速度快,都可用于标记大鼠牙髓干细胞。相较DAPI而言,CM-DiI对大鼠牙髓干细胞的细胞毒性更小。