CRISPR敲减猪CMAH基因的质粒构建及慢病毒的包装

目的:构建靶向猪CMAH基因的慢病毒CRISPR-Cas9敲减质粒及进行慢病毒的包装。方法:设计并合成CMAH基因gRNA的靶序列并将其与Lenti CRISPR-v2载体连接;连接后转化大肠杆菌DH5α,筛选出重组子后酶切鉴定与测序;制备VSV-G、Rev、Gag/Pol等质粒用于包装慢病毒。结果:成功构建猪CMAH基因CRISPR-Cas9敲减质粒并包装出相应慢病毒。结论:利用CRISPR-Cas9基因编辑技术能够构建敲减猪CMAH基因的质粒并能够使用其包装出病毒,为后续感染猪动脉内皮细胞(porcine aorta endothelial cell,PAEC)细胞敲减CMAH基因及功能验证奠定基础。

采用Gal抗原缺失鼠评价GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织的免疫原性

目的比较在Gal抗原缺失小鼠皮下分别植入GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织与野生型猪软骨组织所引起的免疫反应。方法将三基因敲除猪软骨组织(KO组)与野生型猪软骨组织(WT组)分别植入Gal抗原缺失小鼠皮下4周,设立假手术组(con)作为阴性对照。4周后抽取小鼠血清检测总IgM抗体和抗Gal抗体。结果野生型猪软骨(WT)材料植入组小鼠总IgM含量平均在(0.525±0.224)mg/ml,显著高于阴性对照(Con)组小鼠总IgM平均含量(0.121±0.050)mg/ml(P<0.05),但与三基因敲除猪软骨(KO)组小鼠总IgM平均含量(0.313±0.061)mg/ml无统计学差异。野生型猪软骨组织具有比三基因敲除猪软骨组织组和对照组更高的抗α-Gal IgM水平(P<0.05),而三基因敲除组与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论上述结果表明GGTA1/B4GalNT2/CMAH基因敲除猪软骨组织在体内几乎没有免疫反应,可作为软骨缺损修复材料。

猫血型荧光PCR检测方法的建立及应用

猫的AB型血型系统由A型、B型和AB 3种血型组成。配型不合可能导致急性溶血性输血反应和新生儿溶血。根据TaqMan探针荧光定量分析原理,通过对猫血型决定基因胞苷-磷酸-N-乙酰神经氨酸羟基酶(CMAH)基因的4个血型相关的位点进行序列比对,设计相应引物以及探针,建立猫血型荧光PCR检测方法。该研究建立的猫血型荧光PCR检测方法与商品化的血型检测试纸条检测结果符合度达100%。此外,研究发现在北京及周边地区采集的269个猫样本中,A型血型占94.05%、B型占5.58%、AB型占0.37%。