炭疽受体CMG2-Fc融合蛋白在CHO细胞中的表达、纯化与鉴定

目的:构建炭疽受体CMG2和人IgG1 Fc片段融合基因载体,转染CHO细胞并通过毒素中和试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素(PA+LF)的能力。方法:将含有CMG2胞外区1-217AA片度基因和人IgG1的Fc片段基因共同连接入pcDNA3.1载体转染CHO细胞并筛选高表达CMG2-Fc的CHO细胞系,通过小鼠RAW264.7巨噬细胞保护试验检测CMG2-Fc拮抗炭疽毒素的能力。结果:获得了表达CMG2-Fc的细胞株,毒素中和实验显示该蛋白可以有效抑制炭疽毒素引起的细胞损伤。结论:CMG2-Fc能够保护小鼠巨噬细胞免受炭疽毒素攻击,提示其可以作为抗毒素治疗炭疽感染。

CMG2-Fc融合蛋白突变体筛选及中和炭疽毒素活性分析

目的:筛选能有效中和炭疽毒素和抵抗炭疽毒素损伤细胞的CMG2-Fc(炭疽毒素受体II-人免疫球蛋白Fc段融合蛋白)突变体。方法:运用FoldX等计算软件分析CMG2与PA晶体学结构,设计能提高CMG2-PA亲和力的突变体分子,并与人IgG1Fc片段构成融合基因,转染CHO-S细胞并通过亲和层析获得CMG2-Fc突变体蛋白,通过亲和力检测和细胞保护实验分析各突变体中和炭疽毒素能力。结果:筛选并表达了8个CMG2-Fc突变体分子,亲和力实验显示其中E117Q突变可明显提高CMG2-Fc与PA的亲和力(KD=1.35×10-11 mol/L),细胞保护实验提示E117Q突变能有效提高CMG2-Fc中和炭疽毒素能力(CMG2-Fc(E117Q)的IC50为15 ng/μL,而wt CMG2-Fc的IC50为50ng/μL)。结论:CMG2-Fc(E117Q)突变体分子可作为拮抗炭疽毒素损伤的炭疽治疗药物分子,进行进一步研究。

炭疽毒素的细胞受体

炭疽杆菌外毒素是三组分蛋白质 ,构成两种毒素。水肿因子 (EF)和致死因子 (LF)分别是腺苷环化酶和金属蛋白酶 ,保护性抗原 (PA)与细胞表面受体结合并将水肿因子或致死因子转移进细胞内发挥毒性作用。在哺乳动物细胞上己发现有两种受体 ,分别是肿瘤内皮标志 8基因编码的细胞表面蛋白ATR/TEM8和毛细血管形态发生基因 2编码的细胞表面蛋白CMG2。这两种受体蛋白的生理功能都不十分清楚 ,它们之间的氨基酸序列有很高的同源性 (4 0 %～ 6 0 % )。氨基酸序列主要分信号肽、细胞外主基、跨膜区、脑浆尾四个区 ,细胞外主基内含vonWillebrand因子A主基或称整合素插入主基 (VWA/I主基 ) ,VWA/I主基内有金属离子依赖性粘连位点 (MIDAS) ,是主基与PA蛋白质相互作用所必不可少的。这两种受体都有几种异构体 ,主要差异在于胞浆尾区的氨基酸长度不同。两种VWA/I主基都有封闭PA功能 ,阻止细胞中毒的作用 。