转基因烟草CMV-CP定性标准样品的研制

讨论了研制实验室检测用转基因烟草CMV-CP品系定性标准样品,并获得了国家标准样品证书.研制内容包括标准样品的制备、最小取样量、均匀性和稳定性评价.首次采用G-S指数法评价定性标准样品的均匀性及最小取样量,确定了该批样品最小取样量为80mg,此取样量下该批样品均匀性符合标准样品制备的要求.相比传统方法,此种方法使定性标准样品的均匀性评价更具科学性、可靠性.

转CMV-CP基因番茄后代的田间抗病性

以土壤农杆菌为介导，用叶盘法转化获得的转ＣＭＶ－ＣＰ基因（黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因）番茄工程植株，通过连续选择和自交，得到Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４和Ｒ５代的转化番茄植株。１９９３～１９９４年采用人工接种和田间自然发病两种方式鉴定转化植株对ＣＭＶ病毒的田间抗性。结果表明，转基因番茄植株对ＣＭＶ侵染有高度抗性。人工接种Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４代转化植株的防病效果达５０％～７３％。有５０％以上的转基因植株始终未被ＣＭＶ病毒侵染，表现为免疫抗性。自然条件下，Ｒ２～Ｒ５代转化植株的防病效果达５７％～７９％。转化植株的产量比对照人工接种的高１０～６０倍。

表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄及其对CMV的抗性

利用根瘤土壤杆菌Ｔｉ质粒转化系统，采用叶盘法将ＣＭＶ－Ｃｐ基因转入番茄细胞中，获得４２株转基因植株，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测，证明ＣＭＶ－ｃｐ基因已进入番茄核染色体中，并能正常表达。通过对转基因植株Ｒ１和Ｒ２代苗期人工接种ＣＭＶ鉴定，发现ＣＭＶ－Ｃｐ基因产物对ＣＭＶ有一定抗性，其抗性遗传符合孟德尔一对基因控制性状的遗传规律并能稳定遗传。

利用发根农杆菌（Agrobacteriom rhizogenes）介导二元载体向番茄导入TMV，CMV外壳蛋白基因的研究

本文用含ＰＲｉ（ＰＲｉＡ４ｂ）的发根农扦菌为介导，将二元载体质粒ＰＢＴＣ－８（Ｔ—ＤＮＡ上有ＴＭＶ—ＣＰ和ＣＭＶ—ＣＰ基因），导入黑龙江省当地番茄品种。用胚轴注射，顶端切口涂抹，子叶切块穿刺等方法感染转化子菌液，诱导出毛状根。滤纸电泳检测有５０％以上的毛状根含有农抒诚和甘露碱。用抗性筛选法亦获得有卡那霉素抗性的毛状根。在穿刺感染子叶切块诱导产生的具卡那霉素抗性的愈伤组织上，获得不定芽与再生植株，经冠瘿碱，ＰＣＲ，斑点免疫结合法检测证明再生植株中有ＴＭＶ和ＣＭＶ基因产物的两种外壳蛋白和农扦碱与甘露碱，获得双转化植株。

转化CMV－cP基因番茄对CMV病毒抗性鉴定

苗期人工接种，对转化ＣＭＶ－ｃＰ基因的番茄品种８８０５Ｒ１～Ｒ４代进行接种ＣＭＶ病毒试验。结果表明：黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因在番茄中的表达，对抑制ＣＭＶ病毒病症状的表现及延迟其发展均起到一定作用。８８０５Ｒ３代对ＣＭＶ的抗性明显高于Ｒ１代，Ｒ４代抗性已基本稳定。当高浓度的ＣＭＶ病毒侵染Ｒ４代植株时，也会出现１００％的发病率，但它们的新生枝叶能正常生长并开花结果。利用半叶法测定８８０５Ｒ。（ｃｐ＋）及８８０５Ｒ４（ｃｐ－）接种叶和新生叶病毒浓度，结果是：ｃｐ（＋）和ｃＰ（－）在接种叶上病毒含量相当，但ｃＰ（＋）的新生叶中病毒含量明显低于ｃＰ（＋）的等位叶，说明ＣＭＶ－ｃＰ基因的存在，限制了ＣＭＶ病毒粒子的迁移和繁衍，最终也减轻了ＣＭＶ病毒的危害程度。

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化辣椒的研究

以辣椒品种‘B162’为试材,探讨了通过根癌农杆菌介导法将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV-CP)基因转化辣椒的适宜条件.结果表明,将辣椒带柄子叶进行预培养2 d后,用D600 nm为0.3的根癌农杆菌菌液浸泡7 min,再经过共培养2 d后转移到筛选分化培养基中进行培养,有利于获得辣椒抗性不定芽.通过对获得的10株抗性不定芽进行PCR检测,其中有2株扩增出目的条带,初步证明CMV-CP基因已经转入辣椒不定芽中.

甜瓜抗CMV转基因植株的分子生物学研究

本研究建立了转目的基因植物基因整台及表达的分子生物学鉴定系统，并用报告基因检测、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ特异扩增、Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔ等方法，研究了用叶盘法经Ｔｉ质粒转化的甜瓜再生植株ＣＭＶ－ＣＰ基因的整合与表达。结果表明：再生植株基因组中整合了ＣＭＶ－ＣＰ基因，长度为１ｋｂ，并能有效表达。表达产物分子量为２４Ｋｄ，确为ＣＭＶ的外壳蛋白，其表达量占细胞总蛋白约５％。

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化番茄的研究

通过根癌农杆菌介导 ,采用叶盘转化法 ,探讨了黄瓜花叶病毒外壳蛋白 (CMV CP)基因导入番茄栽培品种‘红宝石’的适宜条件 .结果表明 :适宜的卡那霉素 (Km)浓度、根癌农杆菌浓度、根癌农杆菌感染时间以及共培养时间分别为 35mg/L、D60 0 约 0 .5、10～ 15min和 2～ 3d ;将诱导形成的抗性愈伤组织转接到含有 35mg/LKm的分化培养基和生根培养基中使其分化不定芽和生根 ,获得了抗Km的番茄再生植株 .对再生植株进行再次离体培养抗Km鉴定和PCR分子检测 ,初步证明CMV CP基因已导入番茄再生植株的基因组中 .

黄河蜜甜瓜CMV CP基因转化及其抗病性鉴定

利用整合有CMVCP基因及NPT-II基因的改建质粒pBim438,以农杆菌为载体,对黄河蜜甜瓜子叶进行转化,以75mg/L卡那霉素筛选转化体,获得了完整的转基因植株。Southern杂交证明转化植株整合了CMVCP基因,Western杂交证明转基因获得了表达。温室CMV攻毒试验及病毒含量测定表明,转基因甜瓜对CMV的侵染表达了较高的抗病性,能够推迟系统症状显症发生,减轻病害发生程度,转基因植株体内病毒含量低于对照。转基因植株抗病性存在差异,筛选出的2个抗性株系中,TM0-1抗性高于TM0-2。

利用PCR技术克隆黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因

黄瓜花叶病毒(CMV)是一种植物正链RNA病毒,它由蚜虫传播,广泛分布于自然界,可以危害单子叶植物及双子叶值物的85科,365属中的775种植物,给农业生产带来很大的危害。1986年 Powell等将编码烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白的基因转入烟草细胞中表达,获得具有抗 TMV 抗性的烟草。由此启示了利用转病毒外壳蛋白基因途径来培育抗病毒植物。本实验室从山东感病烟草中分离得到一株 CMV(CMV-SD),以此病毒的 RNA 为模板合成 cDNA,利用 PCR 技术成功地克隆到其外壳蛋白基因,对此外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了测定,结果表明它是属于 CMV WT 亚组的一株病毒。

转CP基因线辣椒对CMV的抗病性组分研究

以转化 CMV外壳蛋白基因 ( CP基因 )的线辣椒 ( Capsicum annuum var. longunt)为试材 ,系统研究了 CP基因介导抗病性的组分和表达特点。摩擦接种黄瓜花叶病毒 ( CMV,浓度 2 0μg/ ml)后 ,转基因线辣椒显症延迟 4～ 1 0 d,显症率和严重度大幅减低 ,仅部分植株表现轻度花叶。接种叶片上 CMV侵入位点数目比未转化对照品种减少 6 7.0 %～ 86 .4 %。接种后第 9天 ,转基因株系接种叶中 CMV含量仅为未转化对照的32 .4 %～ 37.3%。病毒由接种叶向邻叶转出始期 ,比未转化对照晚 9～ 1 5h。接种后 3d,转基因株系 1 6— 1 3的未接种叶中未能检出 CMV,而同期未转化对照已有 4片邻叶检出了 CMV。接种后 6 d,1 6— 1 3仅上下位相邻叶检出了 CMV,此时对照已全株带毒。转基因株系接种后 6 d,整株 CMV含量为未转化对照的 4 2 .5%。这表明线辣椒 CP基因介导的抗病性是多组分的 ,包括对病毒的抗侵入。

CP基因转化的线辣椒抗卡那霉素和抗CMV特性的遗传

利用根癌土壤杆菌 ,采用叶盘法转化线辣椒 (Capsicum annuum var.longunt)优良品种陕 82 12 ,建成了能同时表达 CMV和 TMV外壳蛋白基因 (CP基因 )的 T1 代纯合系。以其自交 T2 ～ T4代 ,以及 T2 代植株与未转化陕 82 12杂交的 F1 代和 F2 代群体为试材 ,研究了抗卡那霉素和抗黄瓜花叶病毒 (CMV)特性的遗传传递规律。结果发现 ,抗卡那霉素标记基因和抗病性基因在自交和杂交各代都能稳定地高效表达 ;两者在自交各代纯合 ;在杂交 F1 代抗药性和抗病性都表现为显性 ;在杂交 F2 代 ,抗药植株对敏感植株 ,以及抗病植株对感病植株的分离比都符合 3∶ 1的理论比例。

抗CMV病毒外壳蛋白CP基因导入黄瓜的研究

将 CMV-CP基因经农杆菌感染介导转化黄瓜子叶 ,将 CMV-CP基因导入黄瓜细胞 ,在含有卡那霉素和羧卡青霉素的 MS培养基上诱导子叶分化 ,获得一批转化处理的黄瓜再生苗 ,分化率为 2 3%左右 ,转基因黄瓜试管苗移栽在蔬菜种植土 :沙 :有机质为 5 :4 :1的混合土中 ,其移栽成活率可达 5 6% ;委托省农科院品种引进中心进行转基因黄瓜再生植株对 CMV的抗性接种试验结果表明 :7号株系为高抗 ,2、4号株系为中抗。

番茄双抗TMV和CMV基因工程的研究

在ＴＭＶ外壳蛋白（ＣＰ）基因的５′和３′端分别合成寡聚核苷酸引物Ｐ１和Ｐ２，并分别引入ＣｌａＩ和ＢａｍＨＩ位点，采用ＰＣＲ技术扩增ＴＭＶＣＰ基因，用ＣｌａＩＢａｍＨＩ消化后重组到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ＋中，并将该基因与ＣＭＶＣＰ基因重组在同一个表达载体ｐＥ３上获得双价ＣＰ基因表达载体ｐＥＴＣ２，转化番茄，获得再生植株。通过点杂交、ＰＣＲ检测和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，证实２、１２和１３号为转ＴＭＶ和ＣＭＶＣＰ基因的工程植株。工程植株在温室中表现正常，比对照植株表现出明显的抗性。

新疆石河子南瓜和加工番茄CMV卫星RNA与RNA3序列分析

为探究石河子地区侵染南瓜和加工番茄的CMV卫星RNA及基因组RNA3的分子变异及株系分化,从石河子蔬菜研究所采集南瓜和加工番茄样品并提取dsRNA,利用RT-PCR方法克隆5个CMV卫星RNA序列和2个CMV RNA3序列,南瓜样品卫星RNA及RNA3分别命名为N-sate和N-R322,片段大小分别为335nt和2 214nt;加工番茄样品卫星RNA及RNA3分别命名为To-9-sate、S18-1、S9、S18-2和To-9-R322,片段大小分别为381nt、396nt、334nt、334nt和2 216nt。卫星RNA序列分析结果显示,卫星RNA的序列差异与地域有一定的相关性,与寄主类别无关。同时这5个卫星RNA序列都不含有CMVYSAT所具有的黄化区域。N-R322和To-9-R322序列分析结果显示,二者均属于CMV亚组ⅠB,且CMV分离物有一定的地域相关性,没有明显寄主相关性。

表达病毒CP基因的转基因南方烟草的攻毒试验

利用抗 Ｃ Ｍ Ｖ、 Ｔ Ｍ Ｖ 的抗血清对转 Ｃ Ｍ Ｖ、 Ｔ Ｍ Ｖ Ｃ Ｐ 基因的南方烟草的６ 个株系即：２ Ｔ６ ，２ Ｔ２０ ，２ Ｔ２５ ，２ Ｃ３１ ， ２ Ｃ３２ 和２ Ｔ Ｃ１００ 进行了 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析， 证明了外源基因已在转基因烟草中得到表达． 经组织培养技术， 将表达外源基因的转基因烟草进行快繁， 然后进行温室的攻毒试验， 收集各抗病株系转基因烟草的套袋自交种子， 进行 Ｆ１ 代植株的大田攻毒试验． 温室和大田攻毒试验都表明， 转 Ｃ Ｍ Ｖ、 Ｔ Ｍ Ｖ Ｃ Ｐ 基因的烟草能够抵抗病毒的侵袭， 且转 Ｔ Ｍ Ｖ Ｃ Ｐ 基因烟草的抗病能力较好， 可能是植物体内 Ｔ Ｍ Ｖ Ｃ Ｐ

香蕉CMV—BH外壳蛋白基因转化香蕉的研究初报

将香蕉ＣＭＶ（黄瓜花叶病毒）—ＢＨ外壳蛋白基因克隆到能在植物里表达的Ｐ（０２２４）载体上，然后再将此基因连同３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子克隆到另一植物表达载体ｐ（Ｂ１２１）的ＨｉｎｄⅢ位点，构成一个既有选择标记的ＮＰⅡ基因，又有报告基因ＧＵＳ的嵌合基因表达载体，且每个基因都有各自的启动子和终止子。利用基因枪将带有ＮＰＴⅡ－ＣＭＶ－ＢＨ－Ｃｐ－ＧＵＳ基因的质粒载体导人香蕉试管苗的幼芽中，培养２ｄ后检测ＧＵＳ基因的表达，观察到不同细胞层次都有ｘ－Ｇｌｕｃ反应。

滇黑两省黄瓜花叶病毒南瓜分离物外壳蛋白基因序列分析

利用免疫捕捉多聚酶链式反应(Immuno-Capture PCR,IC-PCR)方法从南瓜的两个黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)云南分离物(CMV-YN)和黑龙江分离物(CMV-HLJ)中扩增获得约700bp的外壳蛋白(Coat protein,CP)基因片段,并克隆到pGEM-T载体中。核苷酸序列测定表明,CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物CP基因长为657bp,编码219个氨基酸,两个分离物的核苷酸和氨基酸同源性分别达到96.8%和97.4%。和国外CMV亚组Ⅰ6个分离物核苷酸序列同源性在90%以上,氨基酸同源性在97%以上,和亚组Ⅱ6个分离物的同源性分别为66.4%和73.4%。和国内亚组Ⅰ10个分离物的核苷酸同源性都在89.5%以上,氨基酸同源性在93%以上,而和亚组Ⅱ两个分离物的同源性分别为68.3%和73.5%。序列分析结果表明CMV-HLJ和CMV-YN两个分离物属于CMV亚组Ⅰ。

转CP基因线辣椒对CMV和CMV-RNA的抗病性比较

本试验以转化 CMV- CP和 TMV- CP基因线辣椒纯合系作试材 ,比较了接种 CMV粒体和CMV- RNA后的发病特点和叶片中的病毒含量。结果表明 :转化线辣椒不仅能抵抗 CMV粒体的侵染 ,而且还能抵抗 CMV- RNA的侵染。不论接种 CMV粒体或 CMV- RNA,CP(+ )线辣椒的系统症状都延迟出现 ,显症株率和病害严重度级别大幅度降低 ,病毒增殖和运转受到抑制 ,接种叶片与新生叶片中的病毒含量明显减低。这一结果证实 CMV- RNA不能克服线辣椒由 CP基因介导的抗病性。

双抗转CP基因线辣椒对非克隆病毒的抗病性

本试验以转化黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因 (CMV- CP)和烟草花叶病毒外壳蛋白基因(TMV- CP)的线辣椒纯合系作试材 ,比较了转化植株对接种 CMV非克隆株系后抗病性的变化以及转化植株对接种 PVX,PVY和 TEV等非克隆病毒后的抗病性变化 .结果表明 :转化线辣椒能抵抗 CMV非克隆株系的侵染 ,抗病表达特点为系统症状延迟出现 ,显症株率和病害严重度级别大幅度降低 ,接种叶片与新生叶片中的病毒含量明显减少 .对 PVX,PVY和