RTS启动子与GUS的嵌合基因在转基因水稻花药中的专一性表达

通过PCR扩增 ,从籼稻品种IR36中克隆了RTS启动子的DNA片段 ;序列分析表明 ,所克隆的DNA片段含 12 5 7个核苷酸 ,与Lee等 (1996 )报告的序列比较 ,核苷酸同源性为 97.1% ;将 - 12 2 8～ + 2 5的RTS启动子区段与GUS编码区组成的嵌合基因插入双元载体的T DNA中 ,经根癌农杆菌介导转化 ,得到转基因水稻植株。GUS活力检测表明 ,此嵌合基因不仅能在花药绒毡层 ,而且还在花药表皮细胞、药室内壁以及花粉中表达 ,而 - 783～ + 2 5的 5’上游区与GUS编码区组成的嵌合基因则未在转基因水稻的花药中检测到其表达。

cmv-3′LTR嵌合启动子对逆转录病毒载体MFG滴度及外源基因表达的影响

为减轻逆转录病毒载体介导的外源基因的沉默,进一步提高逆转录病毒载体MFG介导的外源基因的表达水平,同时探讨逆转录病毒3′端长末端重复序列(long terminalrepeat,LTR)内U3区对病毒基因表达的影响,将逆转录病毒载体3′端LTR内的U3区用cmv核心增强子、启动子序列替代,同时去除了3个与逆转录病毒载体启动子甲基化有关的序列NCR、DR,并以egfp为报告基因,构建了MFG egfp和MFG egfp cmv表达载体。结果显示:利用cmv启动子替代MFG载体3′端LTR的U3启动子序列,会显著降低MFG载体的病毒滴度及其介导的外源报告基因的表达。提示利用cmv启动子替代病毒载体的3′端LTR内的U3区,并不是提高MoMLV(moloneymurineleukemivirus)逆转录病毒载体介导外源基因的表达及其病毒滴度的理想策略。结果也同时提示:在MoMLV逆转录病毒3′端LTR的U3区,可能存在与病毒RNA加工、成熟及稳定性有关的信号序列。

嵌合性启动子HRE.CArG的构建及对肝癌细胞乏氧和射线应答的调控

实体瘤中乏氧区的存在是影响放疗效果最主要的因素之一[1].在一个基因启动子内利用乏氧和射线应答元件联合,限制治疗基因仅在乏氧和/或受照组织激活,可提高治疗比率.该文研究目的是构建包含HREs和CArG元件的乏氧-辐射嵌合性基因启动子,并观察乏氧及照射时该启动子诱导增强的绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)在BEL7402肝癌细胞中的表达变化.

端粒酶逆转录酶启动子hTERT／U6嵌合启动子的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的构建有hTERT/U6嵌合启动子的小干扰RNA(small interfere RNA,siRNA)表达载体,并用分子生物学的技术和方法验证其对肝癌细胞SMMC-7721的效应。方法构建siRNA-EGFP-PTZU6+1表达载体,将其转染到稳定表达EGFP的肝癌细胞株7721(EGFP-7721),观察细胞荧光的变化及RT-PCR,Western blot筛选出更有效的siRNA-EGFP-PTZU6+1载体。PCR扩增端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase promoter,hTERT)启动子的核心序列,构建针对EGFP基因的hTERT/U6嵌合启动子siRNA表达载体(EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT),正向和反向插入的hTERT启动子各1个,并将其转染至EGFP-7721细胞中,RT-PCR验证其效应。结果RT-PCR,Western blot结果表明两重组质粒siRNA-EGFP-PTZU6+1转染EGFP-7721细胞后EGFP基因的表达无统计学差异,但与对照组比较均显著抑制了EGFP基因(P<0.01)。而且,RT-PCR结果显示,反向插入的重组质粒EGFP-siRNA-PTZU6+1-U6/hTERT与对照组相比显著抑制了EGFP基因的表达(P<0.05)。结论构建的含hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体在肝癌细胞中具有功能活性,为探讨基因的靶向治疗奠定了基础。

对乏氧和射线应答的嵌合性基因启动子的研究进展

介绍两种应用射线和乏氧应答启动子调节的GDEPT(定向基因酶前体药物治疗)系统。用治疗性、条件性或肿瘤特异性启动子控制GDEPT是一种控制靶基因在肿瘤内表达的方法。通过选择性启动子,使基因靶向肿瘤内表达,提高特异性和靶向性,解决了肿瘤基因治疗中的主要限制。

双向启动子的分离及嵌合基因拼接的优化研究

从带有 pTi15955 TR-DNA 片段的克隆 pAR17出发,经一系列 DNA 重组步骤,我们分离到了—490bp 的双向启动子 DNA 片段。DNA 顺序分析表明,与 pTiAch5一样,pTi15955TR-DNA 的基因1′和基因2′启动子皆具典型的 TATA 盒,它位于起始密码上游90bp 处,但基因1′和2′皆无典型的 CAAT 盒。转录起始可能在基因1′和2′的起始密码上游60bp 处。为了研究嵌合基因5′端启动子的优化拼接以及3′末端结构方向对嵌合基因表达的影响,我们对分离的双向启动子2′进行了改造,将 BamHI 酶切位点移到了起始密码 ATG 处,并构建了三种萤光素酶嵌合基因,经植物基因工程载体 pGV3850,分别将这三种嵌合基因引入了烟草,结果表明,经改造的双向启动子2′要比未改造的强,胭脂碱合成酶基因3′末端当以反向与萤光素酶结构基因相拼时大大降低其基因在转化烟草中的表达。

T细胞活力响应性启动子(TARP)萤光素酶报告系统在CAR⁃T细胞功能鉴定中的应用

目的将T细胞活力响应性启动子(TARP)纳米萤光素酶报告基因系统导入含有嵌合抗原受体(CAR)编码基因的慢病毒质粒中,为CAR⁃T细胞活化水平及功能鉴定提供一种便捷的、定量分析的方案。方法采用全基因合成及分子克隆技术构建重组质粒。慢病毒包装并感染人原代T淋巴细胞,流式细胞术检测慢病毒感染T细胞的阳性率。通过萤光素酶报告基因系统、Western blot法、流式细胞术、小动物活体成像技术鉴定CAR⁃T细胞的功能。结果酶切鉴定和质粒测序结果表明重组质粒的顺利构建,流式细胞术结果显示CAR⁃T细胞的正常制备,萤光素酶活力检测结果表明本系统能够动态响应CAR⁃T细胞的激活,体外功能实验证实本系统能够反映CAR⁃T细胞的耗竭状态,小动物活体成像结果体现了本系统在小鼠体内的示踪功能。结论TARP纳米萤光素酶报告基因系统为评估CAR⁃T细胞活化水平,耗竭状态以及体内示踪等方面提供了更加便捷、灵敏、定量分析的技术手段。

射线联合嵌合启动子介导的自杀基因对肿瘤细胞的靶向杀伤作用

目的探讨放射线联合新型嵌合启动子介导辣根过氧化物酶／吲哚乙酸（HRP／IAA）自杀基因系统特异高效的抗肿瘤作用。方法构建含有4个串联放射反应元件CArG、含或不含巨细胞病毒（CMV）启动子的人端粒酶逆转录酶嵌合启动子，筛选肿瘤特异性及放射诱导性强的嵌合启动子，下游连接自杀基因辣根过氧化物酶（HRP），检测放射线联合基因治疗对肿瘤细胞HeLa、A549和MHCC97增殖及凋亡的影响。结果人胚肺成纤维细胞MRC-5中C4-hTC嵌合启动子的活性（0．1±0．0）明显低于肿瘤细胞株HeLa、A549和MHCC97（0．6±0．0、1．1±0．1和1．0±0．1，P〈0．01），经过6Gy射线诱导后，这种差异更加显著（活性分别为0．2±0．1、1．7±0．2、2．3±0．2和2．3±0．1，P〈0．01）。在肿瘤细胞株HeLa、A549和MHCC97中，嵌合启动子C4-hTC-HRP携带的自杀基因系统SER值分别为2．64、2．75和2．82，显著高于单纯hTERT启动子。在肿瘤细胞中，除阴性对照质粒pGL3-contr01．Luc外，自杀基因与放射治疗相联合对肿瘤细胞的生长抑制明显高于单一治疗方法，而联合组中pC4-hTC．HRP／IAA系统与放射联合的生长抑制作用最显著，对HeLa、A549和MHCC97细胞的生长抑制率分别为67．3％、69．0％和64．6％。在肿瘤细胞中，除阴性对照质粒pGL3-control-Luc外，联合组诱导的早期凋亡率明显高于单一治疗方法组，其中pC4-hTC-HRP／IAA系统与放射联合诱导的凋亡率最高，HeLa、A549和MHCC97细胞凋亡率分别为39．6％、33．0％和33．2％。结论新型嵌合启动子C4-hTC具有良好的肿瘤特异性及放射诱导性，放射线联合基因治疗对肿瘤细胞具有特异高效的杀伤作用，在肿瘤的基因放疗中具有较强的应用潜力。

ocs/mas,一个受损伤和植物激素诱导的嵌合启动子的构建与功能分析

选择适宜的转录调控序列以提高启动子的转录效率,增强外源基因在转基因植株中的表达,对改良作物的抗病虫性具有重要意义。将甘露碱合成酶基因(mas)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)增强子杂合而成的嵌合启动子ocs/mas与GUS报告基因连接,构建了植物表达载体pOMS-GUS。对照载体pMAS-GUS仅携带mas启动子驱动的GUS基因。利用根癌农杆菌介导法,将以上植物表达载体分别转化烟草。应用半定量RT-PCR和GUS荧光定量分析法分别检测不同胁迫条件下启动子驱动的GUS基因表达量的变化。结果显示,未诱导处理的转基因植株GUS基因仅有微弱表达。伤害处理1h后,mas启动子驱动的GUS活性是未诱导处理的1.8倍,而嵌合启动子ocs/mas的诱导表达活性是未处理的5.7倍。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)处理也诱导了较高水平的ocs/mas嵌合启动子活性;而且SA和MJ联合作用时呈现叠加效应,转基因烟草的GUS活性明显高于伤害处理后的GUS表达水平。以上结果表明,ocs/mas嵌合启动子是一种强诱导型启动子,可以接受多种刺激因子的诱导,从而为更有效地改良作物抗病虫的能力提供新的候选高效启动子元件。

靶向治疗肺癌双自杀基因HSV-TK/CD真核表达载体的构建

背景与目的本研究构建CEA启动子和CMV增强子调控表达的HSV-TK和CD基因双顺反子真核表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD。方法根据特异性引物PCR扩增获得CEA启动子(pCEA),巨细胞病毒的早期基因增强子(CMVE)序列,用基因重组的方法替换载体PIRES-EGFP通用启动子pCMV,得到重组质粒CMVE-PCEA-IRES-EGFP,转染重组质粒到表达CEA的肺癌细胞株中进行绿色荧光蛋白检测,确定启动子能有效启动报告基因在CEA阳性的肺癌细胞中的表达。用PCR扩增得到目的基因HSV-TK和CD,将目的基因HSV-TK和CD亚克隆到载体CMVE-pCEA-IRES-EGFP上,得到自杀基因HSV-TK/CD双表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD。结果经酶切、PCR及DNA测序鉴定,双自杀基因真核表达载体CMVE-pCEA-TK-IRES-CD已成功构建,嵌合启动子CMVE-pCEA调控下能启动下游报告基因在CEA阳性的肺癌细胞株的表达。结论成功构建了嵌合启动子CMVE-pCEA启动的双自杀基因HSV-TK/CD真核表达载体,为下一步研究双自杀基因对于CEA阳性表达的肺癌的治疗奠定了基础。

辐射诱导启动子介导的腺病毒自杀基因联合照射的抗肿瘤效应

目的检测利用肿瘤特异性辐射诱导嵌合启动子介导的腺病毒自杀基因系统联合放射线对肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法构建含有6个串联放射反应元件的人端粒酶反转录酶基因嵌合启动子调控辣根过氧化物酶表达的复制缺陷型腺病毒，同时建立人肝癌细胞MHCC97裸鼠皮下移植瘤模型，瘤内注射重组腺病毒，腹腔注射吲哚乙酸，同时给予叮射线照射，观察肿瘤生长、裸鼠生存状态，以及肿瘤组织和正常器官的组织病理学改变。结果分组处理后第31天，阴性对照病毒组、单纯病毒组、单纯照射组及联合组裸鼠皮下移植瘤相对体积分别为49．23±4．55、27．71±7．74、28．53±10．48和．11．58±3．23，组间差异具有统计学意义（F=16．288，P〈0．01），其中联合组的肿瘤抑制作用最强，生长抑制率为76．5％；与对照组相比，非对照组均能延长裸鼠中位生存期（r=18．307，P〈0．01），其中联合组差异最显著（13d与43d）；光镜下各治疗组肿瘤组织均出现坏死，其中联合组肿瘤坏死较多，而正常器官组织病理学检查未发现治疗相关损伤改变。对照组裸鼠肝脏显示出密集的肝癌转移灶，单纯治疗组仅有少数转移灶，而联合组肝脏未见明显异常。结论复制缺陷型腺病毒介导的靶向自杀基因治疗联合放疗能有效抑制肝癌皮下移植瘤生长，延长裸鼠生存期，为肝癌的治疗提供了新的途径，具有良好的应用前景。

复制缺陷型腺病毒载体介导hVEGF cDNA在C2C12和NIH3T3细胞中的表达

为提高hVEGFcDNA在心肌中的表达 ,降低在其它组织中表达可能产生的不良反应 ,用PCR法得到人磷酸肌酸激酶 (MCK)增强子和CMV核心启动子 .利用克隆技术构建了含双拷贝MCK增强子 (m)和人巨细胞病毒 (CMV)核心启动子 (c)的嵌合启动子 (mmc) ,构建真核表达质粒pK3 mmcLacZ ,制备受mmc嵌合启动子调控的重组腺病毒Ad mmcVEGF .经X gal染色、β 半乳糖苷酶定量分析、RT PCR、hVEGFELISA定量分析、VEGF活性测定等研究表明 。

携带CAR启动子的重组AAV9病毒在小鼠体内表达分布特性研究

基因治疗正日益成为罕见病乃至单基因遗传病的首选治疗策略,提升基因药物的体内表达是重要研究领域。本文选择4种短内含子构建了4种嵌合型启动子CAR、CAS、CAP、CAT,通过Gluc报告基因表达活性比较发现,CAR强度明显高于CA,仅次于CAG。选择CAR启动子构建和制备了携带EGFP报告基因的重组病毒rAAV9-CAR-EGFP,经SDS-PAGE分析可见病毒外壳蛋白条带清晰,表明纯度良好;Southern杂交检测可见基因组以自身互补的双链DNA为主。在新生小鼠和成年小鼠中用静脉注射(IV)和侧脑室注射(ICV)两种途径给药,研究了rAAV9-CAR-EGFP的体内表达分布特性。结果表明,新生鼠ICV注射rAAV9-CAR-EGFP在其脑部和脊髓可以观察到EGFP高转导效率和高强度表达,新生鼠IV注射rAAV9-CAR-EGFP可在脑组织观察到明确的EGFP绿色荧光,表明该病毒可有效穿越血脑屏障,但IV注射对于中枢神经系统的转导效率和表达强度明显低于ICV注射。无论是IV注射还是ICV注射,神经和肌肉系统中都可观察到EGFP的持续表达;同时还可以观察EGFP蛋白在外周组织中广泛分布,其中以肝脏、骨骼肌和心肌最为显著。另外,成年鼠IV注射rAAV9-CAR-EGFP可在肝脏观察到EGFP持续表达,而新生鼠IV或ICV注射则肝脏中EGFP的表达会随动物生长而明显衰减。这些研究结果为我们下一步用AAV9携带CAR启动子介导目的基因表达治疗中枢神经系统疾病如脊髓性肌萎缩症的基因药物设计奠定了基础。

植物遗传工程

933108检测转基因烟草植株的快速有效方法[英]/Rave-lonandro,M.…//Bto Techaiques.-1993,14(2).-186～190[译自 DBA,1993,12(6),93-03347]开发了快速、有效检测转基因烟草植株的方法。该方法减少了鉴定转基因植株所用的组织量。采用的质粒为 pMON533,是双元质粒 pMON530(含有 GUS 选择标记 DNA 盒)的衍生物。

植物遗传工程

933448转基因马铃薯植株对病毒的抗性[会,英]/Huis-man,M.J.…//Euphytica.-1993,63(2).-187～197[译自 DBA,1993,12(8)。

农业其他

902500 经免疫电子显微镜接高压冰冻、冰冻取代和低温包埋研究外源蛋白在转基因植株中的原位定位[英]/Hippe,S.…//Eur.J.Cell Biol.-1989,50(1).