CN/NFAT信号通路与骨代谢研究进展

近年来,随着对骨质疏松症研究的日益增多,与其有关的信号转导途径的研究也在深入开展。鉴于骨质疏松症的发生主要体现在由成骨细胞引起的"骨重建"与破骨细胞引起的"骨吸收"相互偶联的动态变化过程中,通过对钙调磷酸酶(calcineurin)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells)(CN/NFAT)信号通路的研究,以期进一步明确骨质疏松症的发病机理,为骨质疏松的治疗及预防提供新的思路和理论依据。

Ca^(2+)/CaN/NFAT信号通路在肿瘤中的研究进展

肿瘤成为危害人类健康的主要原因,其发生发展与免疫炎症密切相关.Ca^(2+)/CaN/NFAT信号通路是目前已知的免疫炎症通路,可促进多种免疫细胞活化,介导免疫炎症因子释放,进而影响机体的免疫功能.目前,Ca^(2+)/CaN/NFAT信号通路在肿瘤中的存在和作用越来越受关注.多项研究表明与该通路与肿瘤发生发展密切相关.故本文从Ca^(2+)/CaN/NFAT信号通路概述、信号通路对肿瘤发生发展的影响、信号通路对肿瘤免疫炎症的作用及与信号通路相关药物在防治肿瘤中的作用四方面进行综述,以期为临床防治肿瘤提供新视角新靶点.

跑台运动通过抑制骨吸收CN/NFATc1信号通路改善慢性肾病小鼠骨代谢和骨结构

目的:通过肾部分切除手术造慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)小鼠模型,研究跑台运动对CKD小鼠骨代谢和骨结构的影响,以及对CKD小鼠骨吸收CN/NFATc1信号通路的作用。方法:4周龄30只C57BL/6雄性小鼠,随机分为CKD对照组(CKD)、CKD运动组(CKD+E)和假手术对照组(SHAM),每组10只。CKD组和CKD+E组小鼠通过肾部分切除手术造成CKD小鼠模型,SHAM小鼠行假手术作为对照;CKD+E组小鼠进行为期8周的跑台训练,末次训练24 h后处死各组小鼠。Micro-CT法检测股骨和第三腰椎骨组织形态计量学指标,ELISA法测试血清骨代谢指标,Quantitative Real-time PCR法测定股骨中CN/NFATc1信号通路相关细胞因子mRNA表达,Western Blot检测骨中Src1和NFATc1的蛋白表达。结果:与SHAM组相比,CKD组小鼠股骨和第三腰椎松质骨BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD显著降低(P<0.01),Tb.Sp和Po(tot)显著升高(P<0.01),血清骨形成指标OC、PICP、PINP和BALP显著降低(P<0.01),血清骨吸收指标CTX、NTX和TRACP显著升高(P<0.01),骨组织TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1、TRAP mRAN表达和Src1、NFATc1蛋白表达显著升高(P<0.01);与CKD组相比,CKD+E组小鼠股骨和第三腰椎松质骨BV、BV/TV、IS、Tb.Th、Tb.N和BMD显著升高(P<0.05或P<0.01),Tb.Sp和Po(tot)显著降低(P<0.05或P<0.01),血清骨形成指标OC、PICP、PINP和BALP显著升高(P<0.05或P<0.01),血清骨吸收指标CTX、NTX和TRACP显著降低(P<0.05或P<0.01),骨组织TRAF6、Src1、PLC、CN、NFATc1、TRAP mRAN表达和Src1、NFATc1蛋白表达显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:跑台运动通过抑制骨吸收CN/NFATc1信号通路,改善CKD小鼠骨代谢和骨结构。

CytochalasinH对小鼠脾细胞增殖的抑制作用及其对Ca^(2+)/CaN/NFAT信号通路的影响

【目的】研究红树林植物大红树内生真菌Phomopsis asparagi DHS-48得到的次级代谢产物cytochalasin H对小鼠(Mus musculus)脾细胞的免疫抑制活性及其作用机制。【方法】用不同浓度(3、6、12、25、30μmol/L)cytochalasin H处理小鼠脾细胞,通过CCK-8活力测定法检测其对刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)诱导小鼠脾细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测cytochalasin H对小鼠脾细胞凋亡的影响;免疫荧光实验检测cytochalasin H对细胞中NFAT入核及钙离子内流的影响;酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)和免疫蛋白印迹法(Western blotting)测定cytochalasin H对脾细胞中NFAT信号通路的影响。【结果】CCK-8实验表明,cytochalasin H对于正常小鼠脾淋巴细胞的毒性比环孢菌素(Cyclosporin A,Cs A)弱,半抑制浓度IC_(50)=(35.07±1.16)μmol/L;流式细胞术显示,cytochalasin H对ConA刺激的脾淋巴细胞无促凋亡作用;cytochalasin H对ConA诱导增殖的小鼠脾淋巴细胞具有显著的抑制效果,IC_(50)=(14.81±0.81)μmol/L,且呈剂量依赖性;免疫荧光结果表明,cytochalasin H在浓度为15μmol/L时显著地抑制了钙离子内流;Western Blotting结果显示cytochalasin H对脾淋巴细胞中CaN、NFAT蛋白(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)的表达具有显著的抑制作用;免疫荧光结果显示,cytochalasin H抑制细胞浆内的NFAT转移到细胞核;ELISA测试结果证明,cytochalasin H能显著抑制下游细胞因子白介素-2(IL-2)的分泌(α=0.05)。【结论】Cytochalasin H通过抑制Ca^(2+)/CaN/NFAT信号通路转导显著抑制T细胞增殖和活化。

Calcineurin/NFAT信号通路上调5型磷酸二酯酶的表达及介导内皮素-1诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探讨Calcineurin/NFAT信号通路是否介导内皮素-1(ET-1)诱导的5型磷酸二酯酶(PDE5)的表达及肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)的增殖;同时验证Calcineurin抑制剂环孢素A及PDE5抑制剂西地那非能否抑制ET-1刺激的PASMCs增殖。方法以ET-1刺激PASMCs增殖,分别于ET-1刺激前给予环孢素A或西地那非抑制Calcineurin或PDE5的活性。采用Calcineurin活性检测试剂盒检测其活性,免疫印迹法检测PDE5的表达,酶联免疫吸附法检测cGMP的含量,3H-TdR渗入法检测PASMCs的增殖。结果 ET-1可激活原代培养的PASMCs中Calcineurin的活性,上调PDE5表达,降低cGMP的水平。Calcineurin特异性抑制剂环孢素A可阻断ET-1的上述作用;抑制PDE5的活性可逆转ET-1导致的cGMP含量减少。而环孢素A及西地那非可分别抑制ET-1刺激的PASMCs增殖。结论 ET-1可通过激活Calcineurin/NFAT信号通路介导ET-1诱发的PDE5表达,进而降低cGMP含量,引起PASMCs增殖;而抑制Calcineurin或PDE5可提高cGMP水平,抑制ET-1诱导的PASMCs增殖。

CaN/NFAT信号通路相关基因在鸡骨骼肌中的表达规律及关联分析

旨在探讨CaN/NFAT信号通路相关基因在鸡生长发育早期不同表型骨骼肌中的表达规律以及各基因之间的调控联系。利用荧光定量PCR技术检测隐性白羽鸡2种表型骨骼肌(腓肠肌外侧头和趾长伸肌)中CaN/NFAT信号通路相关基因(CnAα、CnB1、NFATc3、MEF2C和PPARGC1A)在出生后不同生长阶段(0、1、3、5、7和9周龄)的相对表达,并对这些基因的表达进行相关性分析。结果表明,除CnB1基因外,其他4个基因mRNA在2种表型骨骼肌中的表达趋势均较相似;2种表型骨骼肌中5个基因的表达从7周龄到9周龄均呈上升的趋势;同周龄2种表型骨骼肌相比,除腓肠肌外侧头PPARGC1A基因各周龄表达均高于趾长伸肌外,其他4个基因表达均是在3周龄时腓肠肌外侧头高于趾长伸肌,而在7和9周龄时则低于趾长伸肌;相关分析结果表明,除CnAα与NFATc3、CnAα与PPARGC1A基因的表达在2种表型肌肉中呈负相关外,其余各基因表达之间均呈正相关。提示,鸡骨骼肌CnAα、CnB1、NFATc3、MEF2C和PPARGC1A基因表达发育模式具有年龄和表型特异性,可能参与调控鸡骨骼肌肌纤维的生长和类型转换。

阻断Cn/NFAT通路对钛颗粒诱导成骨细胞分泌IL-6和PGE_2的影响

目的:观察阻断钙调磷酸酶(Cn)/活化T细胞核因子(NFAT)通路对钛颗粒诱导成骨细胞分泌IL-6和PGE2的影响。方法:取新生大鼠头颅骨,经消化法获取成骨细胞,根据培养条件,分为钛颗粒组、钛颗粒/VIVIT肽组、VIVIT肽组和对照组。细胞培养96 h后行Western blot检测NFATc1蛋白表达,于6、24、96 h离心后取细胞培养上清,用ELISA法检测各组IL-6和PGE_2的含量。结果:钛颗粒组NFATc1表达高于对照组(P<0.01),钛颗粒/VIVIT肽组NFATc1表达显著低于钛颗粒组(P<0.01),钛颗粒组培养上清IL-6和PGE_2含量各时间点均显著高于对照组(P<0.05),钛颗粒/VIVIT肽组较钛颗粒组各时间点均显著降低(P<0.05)。结论:11R-VIVIT肽特异性阻断Cn/NFAT通路可显著抑制钛颗粒诱导的成骨细胞IL-6和PGE_2的分泌。

microRNA-124调控NFAT信号通路的机制及其对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

肺动脉高压（pulmonaryarterialhypertension，PAH）以肺血管阻力和肺动脉压力升高为特征的致命性疾病，虽然病理机制尚不完全清楚，但肺动脉平滑肌细胞（pulmonarya arefialsmoothmusclecells，PASMC）在发病早期的异常增生、去分化和迁移对于PAH的形成和发展起到关键作用。诱发PASMC异常增生的因素很多，其中包括肺泡慢性缺氧。近期的研究表明，活化T细胞核因子（NFAT）与PASMC增殖及PAH形成有关联。microRNA（miRNA）是一类小分子非编码RNA，通过与靶基因3’非翻译区特异性结合，使靶mRNA降解或翻译受阻，在转录后水平负调控基因表达。大量的文献已表明，miRNA表达异常与多种人类疾病的发生发展有关，关于miRNA在PAH形成中的异常表达及功能研究最近也有一些报道。例如，miR-21是一个研究报道较多且与PAH有关的miRNA，miR-21在PAH动物模型和PAH患者均有上调。作者发现miR-21通过抑制多个靶基因（PDCIM、Sprouty2和PPARot）促进HPASMC增殖和迁移。miR-210是对氧浓度最敏感的miRNA，直接受控于缺氧诱导因子HIF．1仅，被视为低氧标志物。本课题组报道了miR．210在低氧刺激的HPASMC和PAH小鼠模型显著上调，其功能是通过抑制靶蛋白E2F3使细胞凋亡受阻，从而破坏了细胞增殖与凋亡间的动态平衡，有助于PAH的发生。近期，本课题组从300多个miRNA中发现，miR．124通过抑制多个靶基因（NFATcl，CAMTAlandPTBPl）显著抑制NFAT信号通路活性，降低NFAT去磷酸化和核移位。miR．124还可以使Jurket—T细胞中NFAT依赖性的IL2转录下降。作者发现缺氧引起人原代肺动脉平滑肌细胞中miR．124表达下降这一现象与缺氧下NFAT的激活相对应。功能上，过表达miR一124不仅可以抑制PASMC的增殖，而且i不可以捅对抑制NFAT信异诵政桌雏特PASMC的会什．袅剥．太研穷结票据示miR．124可能且有治疗PAH的港在应用价储．

CaN/NFAT信号通路与肺癌骨转移的关系

CaN/NFAT信号通路在免疫系统、神经系统和心血管系统中的作用目前比较清楚。近期研究发现此信号通路具有致癌的潜能:对肿瘤细胞、破骨细胞和成骨细胞均有影响,而肿瘤骨转移的发生是这三种细胞相互作用的结果。因此,CaN/NFAT信号通路可能在恶性肿瘤骨转移的发生中发挥重要作用。

MLP参与心肌肥大发生过程与Calcineurin/NFAT信号通路有关

心肌肥大是心肌细胞面对多种病理刺激时的共同反应,以心肌细胞体积增大和胚胎期基因的重新表达为标志.心肌发育调控基因肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein,MLP)的表达异常与心肌肥大有关.为研究MLP参与心肌肥大发生的分子机制,采用去氧肾上腺素(phenylephrine,PE)刺激大鼠原代培养心肌细胞,建立心肌细胞肥大模型,采用RNAi技术敲减MLP的表达,分析MLP与肥大信号通路钙调神经磷酸酶(calcineurin)/活化T细胞核因子(nuclearfactor of activated T-cells,NFAT)的关系.结果显示,原代培养的心肌细胞经一定浓度的PE刺激后细胞表面积增加,肥大标志蛋白ANP、BNP表达增高,并伴有MLP表达上调.RNAi方法敲减MLP的表达则明显抑制PE诱导的心肌细胞表面积增加和BNP表达增高,并且直接影响NFAT的转录激活活性,提示MLP与心肌肥大的发生密切相关,并且可能是通过calcineurin/NFAT信号通路而参与心肌肥大的发生.

CaN/NFAT信号通路在有氧运动改善高血压心肌肥大中的作用

目的:探讨有氧运动对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertension rat,SHR)心肌钙调神经磷酸酶/活化T细胞因子(calcineurin/nuclear factor of activated T cells, CaN/NFAT)信号通路的影响,以及A激酶锚定蛋白150(A-kinaseanchoringprotein150,AKAP150)在其中的作用。方法:12周龄雄性SHR以及正常血压对照组大鼠(Wistar-Kyotorat,WKY),随机分为正常血压安静组(WKY-SED),正常血压运动组(WKY-EX),高血压安静组(SHR-SED),高血压运动组(SHR-EX)。运动组进行12周中等强度跑台运动。12周后取心脏,HE染色、Langendorff离体心脏灌流、免疫组化、免疫细胞荧光、Western blot等方法进行实验。结果:1)经12周有氧运动,WKY和SHR运动组收缩压均显著低于各自安静组;2)与WKY-SED组相比,SHR-SED组左心室内压上升最大速率(maximal rate of increase in left ventricular pressure,+dp/dt_(max))、左心室内压下降最大速率(maximal rate of decrease in left ventricular pressure,-dp/dt_(max))绝对值显著降低,SHR-EX组与SHR-SED组相比,+dp/dt_(max)、-dp/dt_(max)绝对值显著升高(P<0.01),左心室收缩压力(leftventricularsystolicpressure,LVSP)升高(P<0.01),LVSP-LVDP升高(P<0.01);3)SHR-SED组CaN和AKAP150的荧光强度高于WKY-SED组(P<0.01),CaN表达高于SHR-EX组(P<0.01);SHR-EX组AKAP150的荧光强度高于SHR-SED组(P<0.01);4)SHR-SED组CaN、GATA结合蛋白4(GATAbindprotein,GATA4)及AKAP150的蛋白表达高于WKY-SED组(P<0.01),p-NFATc3/NFATc3的比值显著低于WKYSED组;SHR-EX组CaN、GATA4的表达低于SHR-SED组(P<0.01),p-NFATc3/NFATc3的比值和AKAP150的表达均高于SHR-SED组。结论:有氧运动下调SHR心脏CaN/NFAT信号通路活性、增加调节因子AKAP150的表达,是运动改善其心脏肥大的分子机制之一。

基于NFAT信号通路的抗LAG3抗体8F-6生物活性检测

淋巴细胞活化基因3(LAG3)在T细胞活化和增殖过程中起负调控作用,通过单克隆抗体封闭LAG3分子可以增强T细胞对肿瘤的杀伤力,因此开发抗LAG3抗体的生物活性检测平台对免疫治疗具有重要意义。前期利用杂交瘤融合及抗体人源化改造技术,得到了一株全人源化的抗LAG3单克隆抗体8F-6,并基于活化T细胞核因子(NFAT)信号通路构建了Jurkat-NFAT-Luc2-LAG3和Jurkat-NFAT-Luc2-LAG3-CD3zeta细胞。本文利用所构建的细胞,通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)和流式细胞技术对抗体8F-6进行亲和力及阻断效果检测。结果表明,抗体8F-6与LAG3分子具有良好的亲和力,可以阻断主要组织相容性复合体II(MHC II)分子与LAG3分子的结合;在报告细胞检测平台中,抗体8F-6在CHO-K1-FCGRIA细胞的协助下可以激活Jurkat-NFAT-Luc2-LAG3-CD3zeta细胞;在Daudi/Raji细胞、人金黄色葡萄球菌肠毒素E(SEE)和Jurkat-NFAT-Luc2-LAG3细胞的反应体系中,相比于对照抗体IgG1,抗体8F-6可以明显提高Jurkat-NFAT-Luc2-LAG3细胞的激活效果。

基于分子对接技术研究铁线透骨草提取物通过Ca2+/NFATc1信号通路对骨质疏松性骨折大鼠骨折愈合的影响

目的基于分子对接技术研究铁线透骨草提取物通过Ca2+/活化T细胞核因子(NFAT)c1信号通路对骨质疏松性骨折大鼠骨折愈合的影响。方法40只SPF级SD雌性大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组各10只,除对照组外均构建骨质疏松大鼠模型,对所有大鼠行骨折造模,造模结束后低、高剂量组分别给予不同剂量铁线透骨草提取液灌胃(100、400 mg/kg),对照组及模型组均给予生理盐水溶液灌胃(5 ml/kg)。给药结束后,观察大鼠骨折端愈合情况并进行评分;检测骨密度水平;苏木素-伊红(HE)染色观察骨痂组织病理结构;采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测血清Ca、白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;取骨折部位肌肉组织采用Western印迹检测磷酸化(p)-NFATc1蛋白表达。对铁线透骨草提取物中所含活性成分收集与筛选,并对有效成分-靶点进行分子对接。结果相较于对照组,模型组骨质疏松骨折愈合评分、骨密度明显降低,Ca、TNF-α、IL-6水平及p-NFATc1蛋白表达均明显升高(P<0.05);而经不同剂量铁线透骨草提取物给药后,骨折愈合评分、骨密度均明显提高,Ca、TNF-α、IL-6水平及p-NFATc1蛋白表达明显降低(P<0.05)。铁线透骨草提取物中主要活性成分为谷甾醇(sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin),分子对接结果显示与Ca2+靶点对接较好的成分是sitosterol,结合能为-6.24,与NFATc1靶点对接较好的成分是sitosterol,结合能为-6.81。结论铁线透骨草提取物能够显著改善骨质疏松大鼠骨折的愈合情况,并且可能通过调节Ca2+/NFATc1通路,进一步影响炎症反应。

钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子信号传导通路对内皮祖细胞增殖作用的研究

目的研究钙调神经磷酸酶-活化T细胞核因子（CaN—NFAT）信号传导通路对内皮祖细胞（EPCs）增殖的作用。方法采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，贴壁培养获得EPCs。比色法测定EPCs增殖能力；免疫印迹法检测EPCs内钙调神经磷酸酶Ap（cnAp）蛋白质水平的表达；逆转录聚合酶链反应法检测EPCs内cnAB和NFAT4的表达。观察不同干预因素24h和48h后对EPCs增殖能力的作用，干预因素48h后对EPCs内CnAβ蛋白质水平表达的影响及对EPCs内CnAB和NFAT4表达的影响。结果苯肾上腺素（PE）使EPCs增殖能力增高；环孢素A（CsA）不仅直接使EPCs增殖能力下降，而且可抑制PE引起的EPCs增殖能力增高。结论EPCs内存在CaN—NFAT信号传导通路，该通路受促进因素及抑制因素的调节；CaN—NFAT信号传导通路对EPCs的增殖有明显作用。

硼替佐米与帕米膦酸二钠在大鼠肢体废用性骨质疏松症模型中的疗效比较

目的:探讨硼替佐米与帕米膦酸二钠在废用性骨质疏松症(DOP)大鼠模型中的疗效。方法:选取16周龄雄性SD大鼠40只,随机分为对照组、假手术组、模型组、帕米膦酸二钠治疗组和硼替佐米治疗组,每组8只。建立DOP大鼠模型。采用显微-CT测定大鼠后肢胫骨显微结构参数;采用酶联免疫吸附试验测定大鼠血清学指标核因子κB受体激活蛋白配体(RANKL)/骨保护素(OPG)浓度比值,血清骨硬化蛋白(Sclerostin)、碱性磷酸酶(ALP)的水平;采用定量聚合酶链反应测定骨组织中骨吸收相关因子Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP)、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(CTX)-1、基质金属蛋白酶(MMP)-3和MMP-9 mRNA的相对表达水平;采用蛋白质印迹法测定大鼠骨组织中成骨分化关键转录因子钙调磷酸酶(Calcineurin)/活化T细胞核因子(NFAT)信号轴和糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)/蛋白激酶B(Akt)信号通路水平。结果:与假手术组比较,模型组大鼠后肢胫骨骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、连通性密度(Conn.D)、结构模型指数(SMI)和骨密度(BMD)降低,骨小梁分离度(Tb.Sp)升高;血清RANKL/OPG浓度比值、Sclerostin水平升高,血清ALP水平降低;骨组织中PINP、CTX-1 mRNA相对表达水平降低,MMP-3、MMP-9 mRNA相对表达水平升高;Calcineurin相对表达水平降低;p-Akt相对表达水平降低,p-GSK3β相对表达水平升高,上述差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,帕米膦酸二钠治疗组和硼替佐米治疗组部分逆转了上述指标(包括后肢胫骨BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp、Conn.D、SMI和BMD,血清RANKL/OPG浓度比值、Sclerostin水平和ALP水平,骨组织中MMP-3、MMP-9 mRNA相对表达水平,骨组织中Calcineurin相对表达水平,骨组织中p-Akt、p-GSK3β相对表达水平),差异均有统计学意义(P<0.05);且硼替佐米治疗组大鼠骨组织中PINP、CTX-1 mRNA相对表达水平升高,NFAT相对表达水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与帕米膦酸二钠治疗组比较,硼替佐米治疗组逆转上述指标的效果更为显著,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:硼替佐米改善DOP大鼠骨质疏松症的疗效优于帕米膦酸二钠。

新疆哈萨克族单纯高血压病患者钾通道和CaN/NFAT信号通路的变化

目的大量研究表明高血压病是一种炎症性疾病,本课题组前期研究从淋巴细胞钾通道水平初步揭示高血压可能是一种炎症性疾病,但具体机制不清。故本研究通过研究新疆哈萨克族单纯高血压病患者外周血淋巴细胞CaN/NFAT信号通路发生的变化,拟揭示钾通道参与高血压病发生发展的具体机制。方法选取2014年2月—2014年11月首诊在新疆医科大学第一附属医院心脏中心的单纯高血压病未使用药物降压治疗的新疆哈萨克族患者。采集静脉血,采用ELISA技术检测hsCRP,根据hsCRP水平将研究对象分为3组:高hsCRP高血压组、低hsCRP高血压组和正常血压对照组,每组各50例。采集外周血分离淋巴细胞。采用Real-time PCR定量技术、Western blot技术检测Kv1.3、TNF-α基因和蛋白表达水平,CaN、NFAT活性。结果高hsCRP高血压组和低hsCRP高血压组Kv1.3、TNF-αmRNA、蛋白表达水平及其CaN/NFAT活性高于正常血压对照组(P<0.05),差异有统计学意义。高hsCRP高血压组Kv1.3、TNF-αmRNA、蛋白表达水平及其CaN/NFAT活性表达水平高于低hsCRP高血压组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论新疆哈萨克族单纯高血压病患者CaN/NFAT信号通路活性增加,钾通道可能通过CaN/NFAT信号通路参与高血压病的发生发展。

加味小陷胸汤水提物通过Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路抑制TGF-β1介导的人胃癌MGC-803细胞上皮-间质转化及侵袭迁移

目的:观察加味小陷胸汤水提物对转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)介导的人胃癌MGC-803细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)及侵袭迁移能力的影响,探讨其调控Wnt5a/Ca^(2+)/活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)信号通路抑制MGC-803细胞EMT和侵袭转移的作用机制。方法:用TGF-β1(10μg·L^(-1))诱导人胃癌MGC-803细胞EMT及侵袭转移模型,分别采用Transwell小室实验、划痕愈合实验、蛋白免疫印迹和免疫荧光法检测细胞侵袭迁移能力,EMT标志蛋白表达和Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路关键蛋白表达以及细胞内Ca^(2+)浓度。结果:TGF-β1能够显著增强MGC-803细胞侵袭迁移能力(P<0.01),下调上皮细胞黏附分子(E-cadherin)水平(P<0.01),上调间质细胞标志蛋白(N-cadherin),转录因子(Snail)和细胞骨架蛋白(Vimentin)表达(P<0.01),并诱导细胞Wnt5a,钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN),活化T细胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells1,NFAT1)总蛋白,磷酸化蛋白p-NFAT1和NFAT1核蛋白表达上调及Ca^(2+)胞内蓄积(P<0.01);而加味小陷胸汤(10,20,40 mg·L^(-1))均可明显抑制这一现象,且40 mg·L^(-1)效果最佳(P<0.05,P<0.01);Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路特异性抑制剂(R)-(+)-Bay-K-8644与加味小陷胸汤40 mg·L^(-1)均可明显抑制MGC-803细胞经TGF-β1介导后的侵袭迁移,上调E-cadherin水平,下调N-cadherin,Snail,Vimentin,Wnt5a,CaN,NFAT1蛋白表达及减少Ca^(2+)在胞内蓄积(P<0.05,P<0.01),且(R)-(+)-Bay-K-8644协同加味小陷胸汤40 mg·L^(-1)抑制作用效果更强(P<0.05,P<0.01)。结论:以上结果提示加味小陷胸汤能通过Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路抑制TGF-β1介导的EMT,进而降低MGC-803细胞侵袭迁移能力。

基于Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路研究小陷胸汤调控Ca^(2+)载量抑制MGC-803细胞侵袭迁移和上皮间质转化作用

目的探讨小陷胸汤对转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))诱导胃癌MGC-803细胞侵袭转移及上皮间质转化的影响,并探讨其可能的机制。方法通过CB-DOCK在线平台(http://clab.labshare.cn/cb-dock/)预测小陷胸汤与活化T细胞核转录因子(NFAT)分子对接。使用质量浓度为10μg·L^(-1)的TGF-β_(1)建立人胃癌MGC-803细胞侵袭转移模型,将MGC-803细胞分为空白组、模型组、小陷胸汤组(0.1、0.2、0.4 g·L^(-1)),为进一步探讨Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路在小陷胸汤抑制胃癌中的关键参与作用,将Wnt5a过表达质粒转染MGC-803细胞,分为空白质粒组、Wnt5a-OE组、空白质粒+小陷胸汤(0.4 g·L^(-1))组和Wnt5a-OE+小陷胸汤(0.4 g·L^(-1))组。分别使用细胞增殖与活性检测(CCK-8)法、Transwell小室实验、划痕愈合实验、蛋白免疫印迹法(Western blot)、免疫荧光法检测MGC-803细胞活力、侵袭能力、迁移能力、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、锌指蛋白(Snail)、Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路关键蛋白Wnt5a、钙调神经磷酸酶(CaN)、NFAT1、磷酸化(p)-NFAT1和NFAT1核蛋白表达以及细胞Ca^(2+)浓度变化。结果分子对接提示小陷胸汤作用于Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT信号通路。与模型组比较,小陷胸汤(0.1、0.2、0.4 g·L^(-1))能明显促进MGC-803细胞活力的丧失,可通过基质凝胶侵入Transwell下室抑制细胞,并以剂量依赖性的方式减缓细胞划痕愈合,并促进E-cadherin的表达,抑制N-cadherin、Vimentin和Snail的表达(P<0.05,P<0.01)。进一步实验表明,与模型组比较,小陷胸汤可以抑制Wnt5a、CaN、NFAT1和p-NFAT1的表达,降低NFAT1核表达和NFAT1介导的转录活性,从而降低细胞Ca^(2+)浓度,且可逆转Wnt5a的作用(P<0.05,P<0.01)。结论小陷胸汤可通过Wnt5a/Ca^(2+)/NFAT通路减弱人胃癌MGC-803细胞的侵袭转移和上皮间质转化(EMT),从而减弱TGF-β_(1)诱导的促瘤作用。这提示小陷胸汤可能通过调节胃癌的侵袭、转移和EMT来预防和治疗胃癌。

刺五加注射液对模拟失重大鼠心血管功能调节作用研究

目的空间失重明显影响航天员心血管系统的正常生理功能,传统中药以整体综合调节发挥潜力,研究传统中药刺五加注射液对模拟失重大鼠心血管功能的保护作用,以改善空间失重环境下的心血管功能。方法采用头低位尾吊大鼠模拟失重,动态超声、心肌酶谱、血清钙离子浓度及心肌相关mRNA和蛋白质表达指标研究失重对心血管功能的影响及刺五加注射液的干预机理。结果与对照相比,模拟失重使大鼠心率显著升高约5%,心室壁厚度、内径、每搏输出量、心排量以及血清Ca^(2+)均有不同程度的减小,左室射血分数和收缩率升高。心肌酶谱中CK和CKMB分别升高33%和42%。对信号通路Ca^(2+)/CaN/NFAT3下游基因Myh6、Myh7、ANF上调,BNP、CaN、α-actin下调,对蛋白质CaN、NFAT3表达量上调,P-NFAT3下调。结论刺五加注射液通过增加失重大鼠心室厚度、每搏输出量和心排量和细胞钙排量,降低心率和收缩率,调节Ca^(2+)/CaN/NFAT3信号通路基因及蛋白表达,发挥心血管保护作用,高剂量药效较好。

抗纤益心方对扩张型心肌病大鼠心肌细胞CaN/NFAT3信号转导通路的影响

目的:探讨抗纤益心方对扩张型心肌病(DCM)大鼠心肌细胞CaN/NFAT3信号转导通路的影响。方法:通过饮用呋喃唑酮水溶液诱导DCM大鼠模型,造模10周后将造模成功的大鼠随机分为模型组,抗纤益心方高、低剂量组和卡托普利组,另设正常组。药物干预4周后超声心动图检查各组大鼠心功能,HE染色及电镜观察心肌组织病理学变化;比色法检测心肌组织中CaN含量,ELISA法检测血清中血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量,Western Blot检测心肌组织中NAFT3蛋白表达情况,Real-time PCR法检测心肌组织中ANP、BNP、NAFT3 mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组大鼠心功能显著降低(P<0.01),心肌细胞病理损伤明显,心肌组织中CaN活性及血清中AngⅡ含量显著增加(P<0.01),心肌组织中ANP、BNP、NAFT3 mRNA表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,各药物干预组均可以显著改善心功能(P<0.05,P<0.01),减轻心肌细胞病理损伤,降低心肌组织中CaN活性及血清中AngⅡ含量,降低ANP、BNP、NAFT3 mRNA表达水平(P<0.01,P<0.05),但抗纤益心方低剂量降低血清中AngⅡ含量差异无统计学意义。结论:抗纤益心方可以改善DCM模型大鼠心功能,减轻心肌组织病理损伤,抑制心肌细胞肥大,可能与调节Ca N/NFAT3信号转导通路有关。