紫杉醇联合放疗对鼻咽癌CNE细胞株凋亡蛋白表达的影响

鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在头颈部恶性肿瘤中占首位。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段,早期病人单纯放疗效果较好,但因其发生部位隐蔽,症状多样性,就诊病人70%为局部晚期病人,单纯放疗疗效较差,局部复发和远处转移为常见的失败原因。为提高局部晚期鼻咽癌的治疗效果,局部放疗和全身化疗相结合成为国内外研究的热点。

转染hEndostatin基因对CNE2细胞株裸鼠移植瘤生长的影响

背景与目的:肿瘤的生长、转移是血管生成依赖性的,血管生成抑制剂有望通过抑制肿瘤血管生成及诱导肿瘤细胞凋亡,有效地抑制肿瘤的生长和转移。本文旨在探讨转染人内皮抑素基因hEndostatin对人鼻咽癌细胞株CNE2裸鼠移植瘤生长的影响。方法:采用脂质体介导法,分别将pBlast-hIL-hEndostatin、pBlast-hEndostatin和pBlast-MCS质粒导入人鼻咽癌细胞株CNE2,MTT法在体外检测转导细胞表达的hEndostatin的活性,并在体内实验中观察转导的CNE2细胞在裸鼠上的致瘤性的差异。结果:转染pBlast-hIL-hEndostatin的CNE2细胞的上清能显著抑制血管内皮细胞ECV304的生长,其在裸鼠体内形成的瘤组织重量和体积均显著低于对照组(P<0.01),生长速度明显慢于对照组细胞。结论:转染hEndostatin基因能有效抑制CNE2细胞在裸鼠体内的生长。

粉防己碱对人鼻咽癌细胞株CNE增殖抑制和凋亡作用的研究

目的:探讨粉防己碱(Tet)对人鼻咽癌细胞株CNE增殖抑制和凋亡的影响。方法:将人鼻咽癌细胞株CNE分为不同浓度Tet处理组,并设立对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE体外生长的抑制作用;采用透射电镜、琼脂糖凝胶电泳技术、流式细胞术Annenxin V/PI EGFP观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE凋亡的影响;采用逆转录-多聚酶链反应技术(RT-PCR)观察Tet对人鼻咽癌细胞株CNE凋亡相关基因mRNA表达的影响。结果:Tet呈浓度依赖性抑制癌细胞体外生长(P<0.05)。Tet处理细胞72 h后,电镜下可见细胞缩小,核裂解,凋亡小体形成;随着Tet浓度的提高,各Tet处理组DNA凝胶电泳梯形条带和细胞凋亡率渐趋明显。与对照组相比较,Bcl-2 mRNA的表达渐减弱,Bax基因mRNA表达渐增强(P<0.05)。结论:Tet可抑制癌细胞生长,促进癌细胞凋亡,其抗癌作用机制可能与下调Bcl-2基因表达和上调Bax基因表达有密切联系。

放疗诱导鼻咽癌细胞株CNE1热休克蛋白高表达

目的鼻咽癌是一种以放射治疗为主的头颈肿瘤,但部分鼻咽癌对放疗耐受。为了解鼻咽癌放疗耐受机制,本实验拟初步探讨人高分化鼻咽癌细胞株CNE1放疗后的蛋白质改变。方法利用固相pH梯度二维凝胶电泳,建立CNE1放疗前后总蛋白质2DE图谱,利用MALDI TOF MS及数据库搜索初步分析和鉴定部分放疗前后差异蛋白质点。结果高分子量酸性蛋白质在CNE1放疗后20min高表达,其中大多为热休克蛋白质HSPs(heatshockproteins,HSPs)。结论放射能诱导CNE1的热休克蛋白高表达,它们可能与鼻咽癌放疗耐受有关。

双靶向性小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对鼻咽癌细胞株CNE2的放射增敏作用

目的研究ZD6474对鼻咽癌细胞株CNE2放射增敏作用。方法采用MTT法测定ZD6474的半数抑制浓度（50％inhibition concentration，IC50），克隆形成实验计算细胞存活率，拟合生存曲线计算放射生物学参数，流式细胞仪检测ZD6474联合放疗的凋亡率及细胞周期分布。结果单纯用药组，CNE2细胞的存活率随ZD6474浓度的增加而降低，其IC50约为2．15μmol·L^-1。ZD6474作用CNE2细胞24h后均见到放射增敏作用，增敏比为1．535±0．134。ZD6474或照射均可增加凋亡率，减少S期细胞比例及增加G2／M期细胞比例（P〈0．01）。结论ZD6474联合照射应用可提高cNE2细胞的放射敏感性并阻碍细胞增殖、促进凋亡和干扰细胞周期分布。ZD6474有望成为EGFR高表达CNE2细胞的放射增敏剂。

生长抑素受体亚型在人鼻咽癌细胞株CNE_2中表达

背景与目的:生长抑素受体(somatostatin receptor SSTR)在许多肿瘤组织均有表达,为生长抑素类似物如奥曲肽用于这些肿瘤的治疗提供了生物学基础,但对生长抑素受体在鼻咽癌中表达情况的研究甚少。本研究旨在了解生长抑素受体基因在鼻咽癌细胞中的表达情况,为生长抑素类似物用于鼻咽癌治疗的进一步研究提供试验基础。方法:采用RT-PCR法和SP免疫组化法联合检测体外培养的人鼻咽癌细胞株CNE2的SSTRs表达,并对PCR mRNA产物测序以鉴定结果。结果:RT-PCR提示人鼻咽癌细胞株CNE2分别表达生长抑素受体亚型SSTR1、SSTR2、SSTR4;免疫组化结果:人鼻咽癌细胞株CNE2表达SSTR1、SSTR2A为强阳性(>60%),表达SSTR4为弱阳性、SSTR2介于两者之间、SSTR3和SSTR5则无表达。结论:我们的研究证实人鼻咽癌细胞株CNE2有多种生长抑素受体亚型基因表达,且以表达SSTR1、SSTR2较多。

蟾蜍灵对人鼻咽癌细胞CNE-1的放射增敏作用

目的:观察蟾蜍灵对鼻咽癌细胞的放射增敏作用。方法:通过MTT法获得单纯蟾蜍灵作用于鼻咽癌细胞CNE-1的细胞存活曲线及抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50),然后采用蟾蜍灵及放射线单独或联合作用于CNE-1细胞,用克隆形成法经SPSS 9.0软件绘制细胞存活曲线,获得不同处理条件下的放射增敏比。结果:单纯用药组,CNE-1细胞的存活率随蟾蜍灵浓度的增加而降低,其IC50约为2.5×10-7mol/L。2.5×10-9和2.5×10-7mol/L的蟾蜍灵作用CNE-1细胞24 h后均见到放射增敏作用,增敏比分别为1.21和1.42。结论:蟾蜍灵对鼻咽癌细胞CNE-1有放射增敏作用,且增敏作用随浓度的增加而增强。

参杞合剂对人鼻咽癌细胞CNE细胞周期及凋亡的影响

目的研究参杞合剂(SQ)在体外对CNE细胞周期及凋亡的影响。方法应用MTT法观察参杞合剂对细胞的抑制作用,流式细胞术观察不同浓度参杞合剂作用不同时间后CNE细胞周期的改变,电镜结合DNA电泳分析参杞合剂诱导凋亡的作用。结果SQ对CNE细胞生长有明显抑制作用,且其作用强度呈现出对浓度和时间的依赖性。CNE细胞在SQ作用下随着时间的延长和浓度的增加,G0/G1期比率下降,S期比率升高,出现S期阻滞。0.0625 g.生药/ml的SQ作用48 h后诱导出凋亡,凋亡率随着浓度的增加、时间的延长而增加,电镜下可见典型凋亡小体。琼脂糖凝胶电泳呈现出凋亡特征性的DNA条带。结论参杞合剂可直接杀伤肿瘤细胞,其机制可能通过阻滞细胞周期S期,诱导肿瘤细胞凋亡实现的。

三氧化二砷诱导鼻咽癌CNE1细胞凋亡及其作用机制的实验研究

目的研究三氧化二砷(As2O3)诱导人鼻咽癌细胞株凋亡作用及其相关机制。方法采用流式细胞术、电镜、TUNEL方法检测As2O3诱导CNE1细胞凋亡作用,免疫组织化学法检测As2O3对CNE1细胞p53、bcl-2和bax蛋白表达的影响。结果经As2O3处理的CNE1细胞发生凋亡,表现为FCM可检测到“亚二倍体峰”,形态学上可见核固缩,染色质边集,凋亡小体形成等改变;TUNEL法可检测到细胞内呈棕色颗粒的凋亡细胞,随着药物浓度升高,凋亡细胞发生率逐渐增多,As2O3目浓度为0.5mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L作用48h后,CNE1细胞的凋亡指数分别为2.66±0.64、8.15±0.96和11.59±0.68,显著高于非药物处理组(0.43±0.43,P<0.05)。经As2O3处理的CNE1细胞内p53和bax蛋白表达较对照组明显增加,与凋亡指数呈正相关关系(r=0.554,P=0.011;r=0.891,P=0.000…);p53和bax蛋白表达也呈正相关关系(r=0.626,P=0.003)。结论As2O3在体外可诱导鼻咽癌CNE1细胞凋亡,其机制可能与上调p53、bax基因表达有关。

尼美舒利诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡作用

目的观察尼美舒利(NIM)诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡作用。方法 0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.8 mmol·L-1NIM作用于体外培养的CNE2细胞株,光学显微镜观察细胞形态和数量变化,透射电子显微镜观察细胞形态和结构变化,噻唑蓝(MTT)法检测细胞悬液吸光度值,流式细胞术(FCM)检测细胞周期分布和凋亡率,蛋白免疫印迹反应(Western Blot)检测细胞环氧化酶2(COX-2)蛋白表达情况。结果不同浓度NIM作用3 d后,CNE2细胞皱缩,数量减少,与药物浓度呈正相关;透射电镜下,细胞形态结构随NIM浓度增加而出现不同程度破坏和死亡征象;相同作用时间下,NIM浓度越高,吸光度值越低;FCM结果显示,NIM各剂量组均在G0/G1峰前出现一个亚二倍体峰(凋亡峰),随着NIM浓度增高,G0/G1期细胞所占比例逐渐下降,G2/M期细胞比例升高,凋亡率逐渐增高;Western Blot结果显示,随着NIM浓度增加,COX-2蛋白表达量逐渐减少。上述结果均与NIM浓度相关,经统计学处理,与对照组和相邻前一浓度组比较,均差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NIM能诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡,且呈剂量依赖性,该作用与抑制COX-2有关。

高压氧对鼻咽癌细胞MMP-9和VEGF表达的影响

目的:通过观察高压氧处理后人鼻咽癌细胞系CNE2Z细胞MMP-9和VEGF的表达,探讨高压氧对鼻咽癌细胞浸润与转移的影响及其机制。方法:将实验用人鼻咽癌CNE2Z细胞分为对照组(A组)、乏氧组(B组)、乏氧加高压氧组(C组)、单纯高压氧组(D组)四组。各组分别处理后,采用细胞免疫化学染色法检测各组鼻咽癌细胞MMP-9、VEGF的表达水平,并在显微镜下观察各组MMP-9、VEGF的表达情况。结果:鼻咽癌CNE2Z细胞MMP-9、VEGF表达的平均光密度值A组与B组比较差异有显著性意义(P<0.05);C组与B组比较差异有显著性意义(P<0.05);D组平均光密度值比B组明显降低,但D组与B组比较差异无显著性意义(P>0.05);A、C和D三组之间比较差异无显著性意义(P>0.05)。结论:高压氧处理可使乏氧条件下人鼻咽癌CNE2Z细胞MMP-9、VEGF高表达减少,而对正常条件下鼻咽癌CNE2Z细胞MMP-9、VEGF的表达无影响,从而提示高压氧处理可能是通过改善乏氧状态而抑制鼻咽癌细胞的浸润与转移。

近致死量照射CNE1后存活克隆生物学性状初步分析

目的放疗后残存癌细胞重新克隆是鼻咽癌放疗复发的主要原因,本实验旨在分析照射残存癌细胞的生物学特征。方法MTT法测定6MV-X射线照射人鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE1的近致死剂量,用近致死量照射获得残存癌细胞存活克隆,然后用流式细胞仪检测存活克隆与亲本细胞株的细胞周期分布,应用二维电泳和质谱技术分析两者的蛋白质表达改变。结果用15Gy近致死量照射CNE1得到了照射存活克隆,并命名为CNE1-15GyR。CNE1-15GyR与亲本细胞株相比:G1/G0期比例增高而G2/M期比例降低;有98个蛋白质表达差异点,其中76个蛋白质斑点上调,22个蛋白质斑点下调;对其中上调的20个蛋白质斑点进行了质谱鉴定,发现细胞间叶来源的中间丝蛋白Vimentin在存活克隆CNE1-15GyR中表达增高。结论照射筛选的存活克隆CNE1-15GyR与亲本细胞株CNE1相比生物学性状发生了改变,细胞间叶来源的中间丝波形蛋白Vimentin在CNE1-15GyR克隆中表达增高,可能与G/G期比例增高有关。

P-gp糖蛋白及其编码的基因在受照射鼻咽癌细胞株中的表达

目的模拟临床放射方法对人鼻咽鳞癌CNE细胞分次照射，检测照射前、后CNE细胞肿瘤多药耐药蛋白P-gp及其编码的基因MDR1的表达和功能。方法对人鼻咽鳞癌CNE细胞进行体外培养，待细胞进入指数生长期后模拟临床放疗方法进行X射线分割照射，2Gy／（d·f^-1），连续5d，总剂量10Gy。于照射前、照射后4、8、13、17和21d分别收取标本进行检测。利用RT-PCR、免疫细胞化学检测照射前、后人鼻咽鳞癌CNE细胞MDR1及P-gp的表达；MTT法检测其耐药指数（RI）的变化，评价P-gp的功能。结果人鼻咽鳞癌CNE细胞MDR1基因照射前呈弱表达，照后4d过度表达，8d到21d表达逐渐降低，与照射前比较，差异有统计学意义（P〈0．05）；其编码的蛋白产物P-gp照射前、照射后4和8d呈弱表达，13至21d表达增高，P-gp迟于MDR1基因高表达。MTT法检测耐药指数结果显示：照射前、照射后4和8d RI值均为1，13、17和21d RI分别增高为8、10和11．2，RI值变化的情况与P-gp的变化情况相一致。结论人鼻咽鳞癌CNE细胞照射前MDR1及P-gp呈弱表达，有原始的低度耐药性；照射后MDR1及功能性P-gp高表达并且持续一段时间。

Cdc2/cdk1和survivin特异性siRNA真核表达载体的设计、构建和鉴定

目的：构建表达靶向cdc2/cdk mRNA和survivin mRNA的siRNA真核表达质粒。方法：从GenBank中搜索Cdc2/cdk1和survivin基因组标准序列,根椐siRNA设计原理构建siRNA真核表达质粒phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivinshRNA。phU6-survivin-shRNA1、phU6-survivin-shRNA2、pU6-HK-shRNA质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和酶切位点,而phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2均含有红色荧光基因作为报告基因和酶切位点。质粒酶切、电泳、测序鉴定;用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞,荧光显微镜下观察、摄片、计数阳性细胞,计算转染效率,激光共聚焦显微镜检测质粒载体绿色和红色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测真核表达质粒对相应蛋白的抑制率。结果：荧光显微镜下计算转染效率显示在转染鼻咽癌细胞CNE2 48h转染率高达45.00%-57.45%;质粒phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1、phU6-survivin-shRNA2和pU6-HK-shRNA酶切后均可见400bp条带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达相应荧光;免疫印迹检测phU6-cdc2/cdk1-shRNA1、phU6-cdc2/cdk1-shRNA2、phU6-survivin-shRNA1和phU6-survivin-shRNA2对鼻咽癌CNE2细胞相应蛋白抑制率分别是33.00±1.41、38.31±1.01（survivin）、36.33±1.21和43.26±1.02（cdk1）。结论：本实验构建了靶向Cdc2/cdk1mRNA和survivin mRNA的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽癌细胞,phU6-cdc2/cdk1-shRNA2和phU6-survivin-shRNA2与phU6-cdc2/cdk1-shRNA1和phU6-survivin-shRNA1相比,转染CNE2 48h后其对相应蛋白的干扰率相对较高。

塞来昔布对3种肿瘤细胞株放射增敏效应的研究

目的观察选择性COX-2抑制剂塞来昔布对3种不同肿瘤细胞株(肺腺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株HeLa、鼻咽癌细胞株CNE)的放射增敏作用。方法选择适当浓度的塞来昔布进行放射增敏实验,设置对照组(C)、药物组(D)、单纯照射组(R)和照射+药物组(R+D),采用集落形成法分别检测塞来昔布对肺腺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株HeLa、鼻咽癌细胞株CNE的放射增敏效应,并绘制细胞存活曲线。结果塞来昔布对3种肿瘤细胞株均显示出放射增敏效应,R+D组与R组相比较,反映放射敏感性指标的SF2、D0.01、D0、Dq出现不同程度的下调。30μmol/L塞来昔布作用A549细胞、HeLa细胞、CNE细胞的放射增敏比SERD0和SERDq分别为1.26和1.34、1.25和1.33、1.24和1.32;当塞来昔布浓度增加到50μmol/L时,放射增敏比SERD0和SERDq分别增至1.74和1.84、1.36和1.47、1.33和1.61。结论塞来昔布在体外实验中可提高3种肿瘤细胞株的放射敏感性,呈浓度依赖性。塞来昔布有望作为放射增敏剂在临床广泛应用。

Bcl-xl和IGF-1受体特异性siRNA真核表达载体的设计、构建及鉴定

目的:构建能表达靶向Bcl-XL mRNA和IGF1RmRNA的siRNA真核表达质粒。方法:从GeneBank中搜索Bcl-XL(NM_138578)和IGF-1R(NM_000875)基因组标准序列,根椐siRNA设计原理各基因选取两段19bp的碱基序列作为靶目标,根据其序列构建siRNA真核表达质粒:psiBcl-XL1和psiBcl-XL2以及psiIGF1R1和psiIGF1R2。随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列,构建表达siRNA的真核表达质粒作为质粒对照psiHK。所构建的质粒均含有增强绿色荧光基因作为报告基因和SalI的酶切位点。质粒经酶切后,电泳鉴定酶切片段;基因测序分析质粒的碱基序列;用脂质体转染鼻咽癌CNE2细胞。转染后培养48h,做流式细胞仪检测转染率并采用共聚焦显微镜检测质粒绿色荧光蛋白的表达,通过RT-PCR检测各组质粒对其基因的干扰率。结果:质粒psiBcl-XL1、psiBcl-XL2、psiIGF1R1、psiIGF1R2和psiHK酶切后均可见400bp小带,与预期插入的目的基因大小一致,基因测序证实碱基序列与模板序列相符;经荧光显微镜下摄片计算转染效率发现:在转染48小时达最高(45%～50%之间);流式细胞仪检测转染后48小时的转染率为48.45%,并在共聚焦显微镜下观察均见大量的细胞表达绿色荧光;psiBcl-XL1、psiIGF-1R1、psiB-clXL2和psiIGF1R2干扰率分别是:22.1%、50%、70.6%、61.8%。结论:本实验构建了靶向Bcl-XLmRNA和IGF1R mRNA、表达短发夹RNA(short hairpin ribonucleic acid,shRNA)的真核表达质粒。重组质粒能有效转染人鼻咽咽癌细胞,psiBcl-XL2和psiIGF-1R2与psiBcl-XL1和psiIGF1R1相比,转染CNE2 48h后其对mRNA的干扰率相对较高。