PPAR-γ对人鼻咽癌CNE1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用及其机制探讨

目的观察氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)对人鼻咽癌CNE1/DDP细胞顺铂耐药性的逆转作用,并探讨其机制。方法将CNE1/DDP细胞分别加入10、20μg/mL PPAR-γ激动剂罗格列酮和等体积培养液进行培养。采用MTS法检测细胞耐药逆转率,流式细胞术检测细胞凋亡率和P-糖蛋白(P-gp)表达,RT-PCR法和Western blot法检测多重耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白基因(MRP)和B淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)mRNA和蛋白表达,Western blot法检测磷酸化Akt蛋白(p-Akt)。结果加入等体积培养液和10、20μg/mL罗格列酮的CNE1/DDP细胞耐药逆转率分别为100.0%、149.3%±11.3%、293.8%±25.5%,其细胞凋亡率依次升高,PPAR-γ、MDR1、MRP、bcl-2 mRNA和蛋白表达以及p-gp阳性率、p-Akt表达依次降低;两两比较,P均<0.05。结论 PPAR-γ对CNE1/DDP细胞的顺铂耐药性具有逆转作用,且呈剂量依赖性;可能与其抑制Akt磷酸化和耐药基因MDR1、MRP表达,并促进细胞凋亡有关。

人鼻咽癌顺铂耐药细胞系(CNE2/DDP)及其亲代细胞(CNE2)的比较基因组杂交研究

背景与目的:比较基因组杂交(comparativegenomichybridization,CGH)是一种在荧光原位杂交(FISH)技术上发展起来的,用于检测两个基因组间相对DNA拷贝数的改变(缺失或扩增),并将这些变化在染色体上进行定位的分子细胞遗传学方法。为全面了解鼻咽癌耐药细胞与药物敏感细胞在基因组DNA水平上可能存在的差异,以及这种差异在肿瘤耐药性产生中的意义,我们用CGH技术对鼻咽癌耐药细胞系(CNE2/DDP)和其亲代药物敏感细胞(CNE2)的基因组DNA进行检测和分析。方法:提取两种癌细胞及正常胎盘组织的基因组DNA,以随机引物法进行荧光标记(CNE2/DDP和CNE2DNA以Fluorescein-12-dUTP标记,探针显绿色荧光;正常胎盘组织以Tetramethylrhodamine-5-dUTP标记,探针显红色荧光),将标记的DNA探针同时与正常淋巴细胞分裂中期染色体进行杂交,杂交信号在荧光显微镜下经CCD(chargecoupleddevice)摄像装置摄取,并通过荧光数字图像分析系统(quipsCGHprogram)进行数据处理,计算两种荧光的比率并绘制分析图。结果:CNE2细胞存在广泛的染色体改变,主要表现在1q,3q,5p,6p,7p,8q,9q,11p,12q,19q的扩增和4q,12p,13p,14p,15p,18,20q,21p,22的缺失。从CNE2诱导的耐药细胞系CNE2/DDP恒定表现为8q,19q的扩增和8p的缺失,其它的染色体均未发现明显异常的?

抑制ATM/PI3K功能区表达对鼻咽癌细胞CNE1辐射增敏的研究

背景与目的:共济失调毛细血管扩张症突变基因(ataxia-telangiectasiamutant,ATM)与细胞辐射敏感性密切相关,已有报道,ATM蛋白(ATM基因编码产物)表达抑制可引起多种恶性肿瘤细胞辐射敏感性的改变。本研究观察ATM/PI3K区反义RNA对鼻咽癌细胞系CNE1ATM蛋白的抑制作用及辐射增敏作用。方法:构建含反义ATM/PI3K区序列逆转录病毒重组体pDOR-atm,经阳离子脂质体转染入CNE1细胞,并命名为CNE1/pDOR-atm。应用半定量RT-PCR法分析反义组和对照组细胞中ATMmRNA的水平,应用流式细胞仪检测表达ATM蛋白的阳性细胞百分率及平均荧光强度,应用集落形成实验及线性二次模型(linear-quadraticmodel,L-Q模型)检测细胞辐射敏感性的变化。结果:在反义组细胞CNE1/pDOR-atm中ATMmRNA指数(mRNAindex,RI)平均为0.23±0.02,在对照组细胞CNE1/pDOR中RI平均为0.51±0.03(P<0.05)。在反义组中ATM蛋白阳性细胞百分率平均为70.8%,ATM蛋白平均荧光强度为1.81±0.12;而对照组中分别为99.3%,4.51±0.18(P<0.01),提示反义组细胞中ATMmRNA水平及蛋白表达抑制。反义组细胞α值为0.40Gy-1,对照组为0.36Gy-1,2Gy辐射增敏比达3.0,提示反义组细胞辐射敏感性增加。结论:抑制CNE1细胞的ATM/PI3K区表达可以达到有效的辐射增敏目的。

三氧化二砷诱导鼻咽癌CNE1细胞凋亡及其作用机制的实验研究

目的研究三氧化二砷(As2O3)诱导人鼻咽癌细胞株凋亡作用及其相关机制。方法采用流式细胞术、电镜、TUNEL方法检测As2O3诱导CNE1细胞凋亡作用,免疫组织化学法检测As2O3对CNE1细胞p53、bcl-2和bax蛋白表达的影响。结果经As2O3处理的CNE1细胞发生凋亡,表现为FCM可检测到“亚二倍体峰”,形态学上可见核固缩,染色质边集,凋亡小体形成等改变;TUNEL法可检测到细胞内呈棕色颗粒的凋亡细胞,随着药物浓度升高,凋亡细胞发生率逐渐增多,As2O3目浓度为0.5mg/L、1.0mg/L和2.0mg/L作用48h后,CNE1细胞的凋亡指数分别为2.66±0.64、8.15±0.96和11.59±0.68,显著高于非药物处理组(0.43±0.43,P<0.05)。经As2O3处理的CNE1细胞内p53和bax蛋白表达较对照组明显增加,与凋亡指数呈正相关关系(r=0.554,P=0.011;r=0.891,P=0.000…);p53和bax蛋白表达也呈正相关关系(r=0.626,P=0.003)。结论As2O3在体外可诱导鼻咽癌CNE1细胞凋亡,其机制可能与上调p53、bax基因表达有关。

CNE1、CNE2鼻咽癌细胞株中ATM/PI3K区基因突变的检测

为了探讨具有不同放射敏感性的CNE1、CNE2鼻咽癌细胞株中ATM/PI3K区基因突变的情况,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和PCR产物直接测序方法(荧光标记的ddNTPs循环测序),对CNE1、CNE2中ATM的PI3K关键区域进行突变检测。结果表明,所测CNE1、CNE2中的ATM/PI3K区序列中没有发生突变,认为鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2间内在的放射敏感性的差异可能与ATM/PI3K区基因突变不相关。

鼻咽癌相关基因BRD7对鼻咽癌细胞CNE1的影响

为了研究BRD7基因对鼻咽癌细胞CNE1的影响,通过脂质体转染方法,将BRD7基因导入NPC细胞株CNE1细胞中.通过细胞生长曲线发现该基因能够抑制CNE1细胞的生长.为了探讨可能的作用机制,进而采用蛋白质组技术研究该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响,从而研究该基因在CNE1中的地位和作用.通过对过表达BRD7基因后鼻咽癌细胞系CNE1的蛋白质表达谱改变的研究,鉴定出19个差异表达蛋白,这些蛋白质包括:BCCIP(BRCA2andCDKN1A(p21(Waf1/Cip1)),FHL2(fourandahalfLIMdomains2),Chloridechannelregulatoryprotein;Hin-1(high-in-normal-1),WISP-1(connectivetissuegrowthfactorrelatedprotein),SREC-4(scav-engerreceptorexpressedbyendothelialcells-2),folatereceptor.这些差异蛋白涉及到基因表达调控、细胞黏附等众多的事件.从另一个侧面研究了BRD7基因与鼻咽癌的关系,扩展了BRD7基因的研究范围,并进一步充实了该基因做为鼻咽癌候选抑瘤基因的证据.

二烯丙基二硫下调cyclin D1和CDK4的表达诱导人鼻咽癌CNE2细胞G_1期阻滞

目的研究二烯丙基二硫(DADS)对人鼻咽癌CNE2细胞的影响及其分子机制。方法采用MTT法检测DADS对CNE2细胞增殖抑制作用;流式细胞术分析DADS对CNE2细胞周期分布的影响;运用RT-PCR和Western blot方法分析DADS作用CNE2细胞后,cyclin D1和CDK4的表达变化。结果 MTT结果显示,不同浓度DADS(90、140、240、400μmol·L-1)处理CNE2细胞48h后,生长抑制率分别为4.0%、13.8%、25.8%、51.2%;流式细胞术分析显示,DADS阻滞CNE2细胞于G1期,并呈浓度依赖性;RT-PCR和Western blot结果表明,细胞周期调控基因cyclinD1、CDK4表达下调。结论 DADS对CNE2细胞的增殖抑制作用与其阻滞细胞G1期有关,并且可能是通过抑制cyclin D1、CDK4的表达使CNE2细胞阻滞于G1期。

NP9对鼻咽癌细胞系CNE1基因表达谱的影响

目的:确定NP9表达对鼻咽癌CNE1细胞基因表达谱的影响。方法:稳定表达NP9基因和稳定转染空载体的CNE1细胞分别作为基因芯片分析的实验组和对照组,用高通量的基因芯片筛选实验组细胞的差异表达基因,荧光定量逆转录PCR验证部分基因表达差异。结果:所分析的14500个基因中,266个检测出有表达差异,其中82个基因呈现表达上调(RA>1),184个基因显示表达下调(RA<1)。显著上调和下调的基因分别为34个(RA>1.5)和75个(RA<1.5)。结论:NP9基因的表达导致了CNE1细胞中与细胞周期调控、细胞增殖和分化、细胞信号转导、细胞黏附相关基因表达的改变,为NP9的功能及分子机制研究提供了新的线索。

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠,观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论反义LMP1能成功抑制LMP1的表达,逆转NPC细胞的恶性表型,为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。

鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中EBV-LMP 1的表达

目的:探讨人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中EB病毒编码的LMP 1基因表达情况。方法:用免疫组化法及Western bolt法分别检测鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中LMP 1基因的表达情况。结果:免疫组化及Western bolt法均显示,CNE2Z细胞中LMP 1呈强阳性表达,而CNE1细胞中LMP 1呈阴性表达。结论:人高分化鼻咽癌细胞系CNE1中没有LMP 1的表达而人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中LMP 1呈阳性表达,鼻咽癌的恶性程度可能与LMP 1的表达有关。

姜黄素逆转卵巢癌耐药细胞株COC1/DDP耐药性及机制的研究

目的：探讨姜黄素对耐药卵巢癌细胞增殖、凋亡及对顺铂敏感性的影响并探讨其机制。方法：采用MTT法检测顺铂、姜黄素、顺铂与姜黄素合用对COC1/DDP细胞的生长抑制作用;用流式细胞仪检测2.5μg/ml顺铂、20μmol/L姜黄素、2.5μg/ml顺铂与20μmol/L姜黄素合用作用于COC1/DDP细胞48h后的细胞凋亡率;RT-PCR法检测上述各组细胞凋亡相关基因Bcl-2、Caspase-3、Survivin的表达。结果：姜黄素浓度在（15-35）μmol/L以内时对COC1/DDP有明显的增殖抑制作用,且呈一定的剂量-效应关系。顺铂的浓度在（1.25-5）μg/ml时加入姜黄素20μmol/L后耐药细胞生存率下降明显（P〈0.05）,尤以顺铂2.5μg/ml和姜黄素20μmol/L联合作用时,耐药细胞生存率下降最明显;COC1/DDP中顺铂与姜黄素联合用药与单独用顺铂相比,凋亡率明显增加（P〈0.05）;顺铂与姜黄素联合用药与单独用顺铂相比Bcl-2、Sur-vivin mRNA的表达明显降低（P〈0.05）,Caspase-3 mRNA的表达明显增高（P〈0.05）。结论：姜黄素能够显著抑制COC1/DDP增殖,并能增强该细胞系对顺铂的敏感性,其机制可能与降低Bcl-2、Survivin基因的表达,增加Caspase-3基因的表达有关。

放疗诱导鼻咽癌细胞株CNE1热休克蛋白高表达

目的鼻咽癌是一种以放射治疗为主的头颈肿瘤,但部分鼻咽癌对放疗耐受。为了解鼻咽癌放疗耐受机制,本实验拟初步探讨人高分化鼻咽癌细胞株CNE1放疗后的蛋白质改变。方法利用固相pH梯度二维凝胶电泳,建立CNE1放疗前后总蛋白质2DE图谱,利用MALDI TOF MS及数据库搜索初步分析和鉴定部分放疗前后差异蛋白质点。结果高分子量酸性蛋白质在CNE1放疗后20min高表达,其中大多为热休克蛋白质HSPs(heatshockproteins,HSPs)。结论放射能诱导CNE1的热休克蛋白高表达,它们可能与鼻咽癌放疗耐受有关。

BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞生存能力的影响

目的：探讨ＢＨＲＦ１ 反义寡核苷酸对表达ＢＨＲＦ１ 的鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２ 生存能力的影响。方法：检测反义阻断ＢＨＲＦ１ 表达后ＢＨＲＦ１－ＣＮＥ２细胞在喜树碱作用下增殖能力和凋亡指数的变化。结果：在喜树碱作用下，应用ＢＨＲＦ１ 反义寡核苷酸组的癌细胞较对照组的增殖率下降，凋亡率增高。结论：反义阻断ＢＨＲＦ１的表达可降低ＣＮＥ２细胞的生存能力。

Caspase-3活性改变与人卵巢癌细胞系COC1/DDP耐药的关系

目的 探讨人卵巢癌顺铂耐药细胞株COC1/DDP中抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达及半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性与人卵巢癌顺铂耐药的关系。方法:采用RT-PCR和Western Blot分析人卵巢癌顺铂敏感细胞株COC1和顺铂耐药株COC1/DDP中Bcl-XL、Bcl-2、细胞色素C的表达和caspase-3的活性。并用流式细胞术测定顺铂作用后COC1和COC1/DDP细胞株的凋亡率。结果:在COC1/DDP细胞中,Bcl-XL和Bcl-2的表达明显高于COC1细胞;顺铂作用后,在COC1/DDP细胞株中细胞色素C的表达明显减少,caspase-3活性明显降低(P<0.05);其凋亡率也明显低于COC1细胞株(P<0.05)。结论:人卵巢癌细胞株COC1/DDP对顺铂产生耐药可能与细胞内Bcl-XL、Bcl-2过度表达抑制了线粒体细胞色素C的释放及caspase-3活性有关。

绿色荧光蛋白报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达:用做转染报道基因的可行性鉴定

目的:将经过"人类化"改造的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因质粒导入鼻咽癌CNE1细胞系内,观察GFP报道基因转染鼻咽癌细胞系CNE1后的表达情况。方法:实验于2004-07/2007-07在广东医学院病理学实验室完成。将带有GFP报道基因的质粒PAT-GFP及PAT-GFP-LMP1在电容960μF,280V条件下电导转染到鼻咽癌CNE1细胞系中,用选择培养液(嘌呤霉素筛选)继续换液培养直至长出抗性细胞克隆,胰酶消化收集细胞。在488nm光激发下,用荧光显微镜检测及流式细胞仪观察转染细胞在活的、固定后或裸鼠体内移植后3组细胞的GFP的表达情况并计算转染效率,并用免疫组化法及Western blot法观察插入目的基因LMP1的表达情况。结果:温度在28～32℃的条件下活细胞有GFP基因稳定而持续地表达,但表达较低,表达率为(16.20±1.70)%,且目的基因LMP1的插入明显影响GFP基因的表达,表达率为(3.48±0.28)%,而在固定后或裸小鼠体内移植后均无表达;目的基因LMP1则能稳定而持续地表达。结论:绿色荧光蛋白报道基因GFP在CNE1细胞系中能稳定而持续地表达,且不影响插入目的基因的表达,可用做转染报道基因。

不同来源LMP1基因转染对CNE1细胞TGFβ1抗性的影响

背景与目的:有研究表明不同来源的EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein1,LMP1)对人高分化鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)细胞株CNE1有不同程度的生长促进作用。本研究拟进一步探讨不同来源的LMP1基因转染对转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGFβ1)抗性的影响及其可能机制。方法:采用脂质体介导法分别将质粒J124(不含LMP1基因的空载体)、J124-B95-8(含B95-8淋巴细胞标准株来源的LMP1基因,简称B95-8-LMP1)和J124-CAO-5(含NPC组织来源的LMP1基因,简称CAO-LMP1)转染CNE1,分别命名三种质粒的转染细胞株为CNE1-V、CNE1-B和CNE1-C;分别用逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)和蛋白印迹法鉴定LMP1基因和蛋白表达;分别用MTT法和流式细胞术观察TGFβ1处理对细胞生长的抑制效应和细胞周期分布的改变;蛋白印迹法检测转化生长因子β受体Ⅰ(transforminggrowthfactorβreceptorⅠ,TGFβRⅠ)、转化生长因子β受体Ⅱ(TGFβRⅡ)以及cyclinD1蛋白的表达;半定量RT-PCR检测p15mRNA的表达。结果:成功建立稳定表达不同来源LMP1的CNE1细胞株CNE1-B和CNE1-C。5ng/mlTGFβ1对CNE1、CNE1-V、CNE1-B和CNE1-C的生长抑制率分别为31.8%、27.9%、

EB病毒潜伏膜蛋白1对鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)对人高分化鼻咽癌CNE1细胞增殖的影响。方法采用电穿孔基因转染技术。将带有绿色荧光蛋白GFP报道系统的EB病毒LMP1基因真核表达质粒导入CNE1,以载体质粒转染及CNE1细胞为对照组,用免疫组化检测LMP1蛋白的表达;用细胞体外增殖实验检测细胞OD比值;用裸小鼠成瘤实验观察移植瘤体积倍增时间和生长率。结果内动物实验细胞移植后CNE1GL组潜伏期缩短,第7、8、9周时,其平均肿瘤体积生长显著高于对照组(P<0.05);体外细胞增殖实验3组细胞OD比值差异无显著性(P>0.05)。结论EBV-LMP1对CNE1细胞的体内增殖能力可能有促进作用。

鼻咽癌CNE_1细胞微波吸收谱测量及其生物效应研究初步

电磁生物学是一门实验科学,主要通过实验方法的建立和实验数据的获得开展电磁生物效应的研究。本文进行鼻咽癌细胞系CNE1对微波辐照的吸收谱测量,搭建以HP83630扫频信号源,标量网络分析仪AV3617为主要器件的程控自动化测试系统,在此基础上设定了可重复操作的实验方法。通过实验发现:CNE1对扫频源微波的最大功率吸收峰(即频率窗)出现在37.257GHz附近,重复性良好3而且对连续微波辐照在几个峰值吸收频率点处均有明显时间窗效应。

上调miRNA-205增强鼻咽癌细胞系CNE1的增殖和黏附

鼻咽癌是发生在鼻咽黏膜的一种恶性肿瘤,具有高度侵袭和转移的特性.鼻咽癌的发病涉及多个癌基因与抑癌基因的共同参与,通过癌基因和抑癌基因之间相互作用的失常,导致细胞的恶性增殖产生癌变,进而发生癌症.