高良姜素对人鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的研究

目的:研究高良姜素对人鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的影响。方法:实验设置空白对照组和实验组(分别加入不同浓度的高良姜素处理CNE2细胞),采用CKK-8法检测CNE2细胞增殖的抑制效果,采用流式细胞仪检测CNE2细胞周期和凋亡的影响。结果:高良姜素能抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖,而随其浓度增加CNE2细胞阻滞于G0/G1期,S期、G2/M期细胞减少,同时细胞凋亡率也随其浓度增高而增加,呈浓度依赖性。结论:高良姜素对人鼻咽癌CNE2细胞株有抑制增殖作用,对细胞周期过程产生阻滞作用,并可以诱导细胞凋亡。

生物钟基因Per1对鼻咽癌细胞CNE2侵袭迁移及与JAK2-STAT3通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨生物钟基因Per1对鼻咽癌细胞CNE2侵袭转移及上皮-间质转化(EMT)的影响,并阐述其与JAK2-STAT3信号通路相关蛋白的关系。方法:实时荧光定量PCR法(qPCR)以及蛋白质印迹法(WB)检测CNE2细胞中Per1基因及蛋白水平;构建Per1基因过表达及干扰慢病毒载体并转染CNE2细胞;实验分为过表达组(Per1-OE)、过表达对照组(Per1-OENC)、干扰组(Per1-sh)、干扰对照组(Per1-shNC);利用划痕愈合、Transwell实验检测Per1基因对各组细胞侵袭、迁移能力;WB检测Per1基因对EMT相关蛋白:E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达的影响;WB检测Per1基因对JAK2-STAT3信号通路相关蛋白表达的影响。结果:WB和PCR结果显示:与人永生化鼻咽上皮细胞NP69相比,Per1在鼻咽癌细胞CNE2中表达降低。通过构建Per1基因过表达及干扰慢病毒载体,有效地上调和下调了CNE2中Per1在转录及蛋白水平的表达,并分别成功筛选出稳转细胞株。划痕实验结果显示:Per1-OE组较Per1-OENC组24 h、48 h细胞迁移率均明显下降(P=0.04,P=0.01),Per1-sh组较Per1-shNC组24 h、48 h细胞迁移率均明显升高(P=0.01,P=0.005)。Transwell实验结果显示:Per1-sh组较Per1-shNC组穿过Transwell小室细胞数明显增加(P=0.02),Per1-OE组较Per1-OENC组穿过Transwell小室细胞数明显减少(P=0.001)。WB结果显示:JAK2、p-JAK2、STAT3蛋白在各组细胞中表达无统计学差异(P>0.05)。Per1-sh组较Per1-shNC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达下降,E-cadherin表达升高(P<0.05),Per1-OE组较Per1-OENC组p-STAT3、N-cadherin、Vimentin的蛋白表达均升高,E-cadherin表达下降(P<0.05)。结论:过表达Per1基因后可抑制鼻咽癌细胞CNE2侵袭、迁移,使N-cadherin、Vimentin、p-STAT3蛋白表达下降,E-cadherin表达增加;干扰Per1基因后则相反,进而表明Per1基因在鼻咽癌细胞CNE2中可能扮演着抑癌基因的角色;同时我们推测Per1基因与p-STAT3的表达有一定的相关性,但其具体作用机制有待进一步研究。

益气解毒方提取物对CNE2细胞的体内外抑瘤作用

目的观察益气解毒方提取物对鼻咽癌CNE2细胞及移植瘤的抑制作用。方法采用MTT法测定益气解毒方多糖提取物、乙酸乙酯提取物(EAE)、乙醇提取物对CNE2细胞体外增殖的影响。建立CNE2裸鼠移植瘤模型,随机分为模型组、EAE组、顺铂(DDP)组和联合治疗组,分别给予生理盐水、益气解毒方EAE、DDP注射液以及EAE联合DDP注射液,12 d后检测各治疗组的肿瘤抑制率。结果益气解毒方EAE对CNE2细胞具有明显的抑制作用,并呈明显的剂量效应关系(P<0.05)。联合治疗组能明显抑制裸鼠CNE2肿瘤的生长,抑瘤率高达56.7%,明显高于EAE组和DDP组(P<0.01)。结论 EAE是益气解毒方中的一种有效的抗鼻咽癌肿瘤成分,EAE联合DDP对裸鼠CNE2鼻咽癌移植瘤的生长具有协同抑制作用。

芒果甙对鼻咽癌细胞系CNE2细胞增殖、凋亡及周期的影响

目的探讨芒果甙治疗鼻咽癌的可行性。方法以不同浓度的芒果甙作用于人鼻咽癌CNE2细胞,检测细胞抑制率、凋亡率及细胞周期。结果芒果甙作用后CNE2细胞抑制率及凋亡率均明显增加,且呈浓度及时间依赖性,P均<0.05;芒果甙作用72h后,随药物浓度增加,CNE2细胞出现S期阻滞;浓度>100μmol/L时出现G2/M期阻滞。结论芒果甙能明显抑制CNE2细胞增殖,诱导细胞凋亡,并具有S期和G2/M期阻滞效应,具有潜在抗肿瘤作用。

二烯丙基二硫诱导人鼻咽癌CNE2细胞凋亡及其可能的分子机制

背景与目的:二烯丙基二硫(DADS)是大蒜中的一种脂溶性单体化合物,对多种肿瘤细胞有促凋亡作用。本实验旨在探讨DADS抑制人鼻咽癌CNE2细胞增殖与诱导凋亡的生物学效应及可能的分子机制。方法:分别采用MTT、光学显微镜、流式细胞仪、DNA琼脂糖凝胶电泳与Western blot检测DADS抑制CNE2细胞增殖与诱导凋亡作用及Bcl-2、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase3)蛋白的表达。结果:MTT结果显示,50、100、200及400μmol/LDADS作用CNE2细胞48h,抑制率分别为3.66%、14.25%、29.66%及61.28%,呈浓度依赖性(P<0.05)。形态学观察发现,DADS处理24h后,部分CNE2细胞变圆,体积明显缩小,胞质强嗜酸性,核固缩、深染,核染色质积聚至核膜周边,呈现凋亡细胞形态学改变。流式细胞术分析显示,50、100、200和400μmol/LDADS作用24h,凋亡率分别为(10.8±1.3)%、(14.8±1.1)%、(21.7±2.0)%及(29.8±2.6)%,呈浓度依赖性诱导CNE2细胞凋亡(n=3,P<0.05)。200及400μmol/LDADS分别作用CNE2细胞24h后,DNA凝胶电泳出现典型梯形条带。Western blot检测显示,50、100、200和400μmol/LDADS处理CNE2细胞24h后,Bcl-2蛋白与β-Actin的灰度值比分别是1.92±0.21、1.21±0.18、0.89±0.14及0.41±0.09,与对照组(2.24±0.26)比较,差异有显著性(P<0.05);Bax蛋白与β-Actin的灰度值比分别是0.78±0.14、1.12±0.19、1.54±0.22及2.08±0.27,与对照组(0.33±0.08)比较,差异有显著性(P<0.05);随浓度的增加,Bcl-2蛋白下调,Bax蛋白表达上调。200、400μmol/LDADS处理CNE2细胞24h后,与对照组相比,Caspase3酶原蛋白条带变细并且可见到蛋白裂解产物,表明DADS可以促进Caspase3的活化。结论:DADS具有抑制人鼻咽癌CNE2细胞增殖和诱导凋亡的作用,其机制可能与Bcl-2蛋白下调,Bax蛋白表达上调导致Bcl-2/Bax比值下降,促进Caspase3的活化有关。

雌激素对转STGC3基因CNE2细胞系生长增殖的影响

为探讨雌激素对STGC3基因抑瘤的促进作用,将重组的pcDNA3.1(+)-STGC3真核表达载体导入鼻咽癌细胞系CNE2,经G418筛选,RT-PCR及蛋白质印迹检测STGC3的表达,获得稳定高表达STGC3基因的pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞系.采用细胞计数法,检测雌二醇(β-estradiol)对体外培养pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞生长增殖的影响.将pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞接种于裸小鼠前肢背部皮下,观察分析雌性与雄性裸鼠成瘤的差别.运用RT-PCR、免疫组织化学及蛋白质印迹方法,分别从mRNA及蛋白质水平,分析STGC3基因在裸鼠移植瘤组织中的表达状况.移植瘤组织病理切片检查,观察瘤细胞形态学变化.用流式细胞仪测定移植瘤组织的细胞周期分布.研究结果表明:细胞体外培养,pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞经β-estradiol处理后,其生长速度明显减缓(P<0.05);裸鼠体内研究,接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞实验组的移植瘤体积和重量均小于对照组,差异有显著性意义(P<0.05);实验组中,雌性裸鼠组移植瘤体积和重量均小于雄性组,差异有显著性意义(P<0.05),雌性裸鼠组移植瘤生长最慢,而对照组中雄性与雌性裸鼠组间瘤块的差异无显著性意义(P>0.05);接种pcDNA3.1(+)/STGC3/CNE2细胞的雌性裸鼠组移植瘤,阻滞于G0/G1期细胞数大于其他各组(P<0.05).上述体内外研究结果显示,雌激素可能具有增强STGC3基因对CNE2细胞系的生长抑制作用.

二烯丙基二硫下调cyclin D1和CDK4的表达诱导人鼻咽癌CNE2细胞G_1期阻滞

目的研究二烯丙基二硫(DADS)对人鼻咽癌CNE2细胞的影响及其分子机制。方法采用MTT法检测DADS对CNE2细胞增殖抑制作用;流式细胞术分析DADS对CNE2细胞周期分布的影响;运用RT-PCR和Western blot方法分析DADS作用CNE2细胞后,cyclin D1和CDK4的表达变化。结果 MTT结果显示,不同浓度DADS(90、140、240、400μmol·L-1)处理CNE2细胞48h后,生长抑制率分别为4.0%、13.8%、25.8%、51.2%;流式细胞术分析显示,DADS阻滞CNE2细胞于G1期,并呈浓度依赖性;RT-PCR和Western blot结果表明,细胞周期调控基因cyclinD1、CDK4表达下调。结论 DADS对CNE2细胞的增殖抑制作用与其阻滞细胞G1期有关,并且可能是通过抑制cyclin D1、CDK4的表达使CNE2细胞阻滞于G1期。

靶向PCNA基因的小干扰RNA对鼻咽癌CNE2细胞周期的影响

目的:研究小干扰RNA抑制PCNA基因表达后对鼻咽癌CNE2细胞株增殖及细胞周期的影响。方法:利用体外合成法合成针对PCNA基因的小干扰RNA(siRNA)序列,应用脂质体转染鼻咽癌CNE-2细胞,实时定量PCR(real-timePCR)和免疫组织化学法观察siRNA干扰后细胞中PCNA mRNA水平和PCNA蛋白表达,倒置相差显微镜观察转染前后CNE2细胞的生长变化,流式细胞仪检测siRNA干扰后的细胞周期。结果:在siR-NA转染CNE2细胞后,细胞增殖受到抑制,蛋白表达不同程度降低,对PCNA mRNA水平的抑制达98.5%,细胞周期在G0/G1停滞。结论:siRNA可在鼻咽癌中有效发挥RNA干扰效应,抑制PCNA mRNA及蛋白表达,降低PCNA活性,抑制鼻咽癌细胞增殖,为鼻咽癌基因治疗提供了新的方法。

芒果甙诱导鼻咽癌CNE2细胞凋亡及其对细胞内钙含量的影响

目的研究芒果甙在体外对人鼻咽癌细胞系CNE2细胞凋亡和细胞内钙离子(IECa2+)含量的影响。方法采用流式细胞术检测不同浓度芒果甙作用24、48、72h后诱导CNE2细胞凋亡和IECa2+含量的影响。结果(1)芒果甙作用24、48、72h后,不同浓度的芒果甙均可诱导CNE2细胞凋亡,随着芒果甙浓度的升高和作用时间的延长而增高;(2)不同浓度芒果甙作用24、48、72h后,CNE2细胞内IECa2+含量显著上升,且随着芒果甙浓度的升高和作用时间的延长而增高。结论芒果甙能显著诱导CNE2细胞凋亡;CNE2细胞内IECa2+含量的升高在芒果甙诱导CNE2细胞凋亡中起到重要作用。

EBV反义LMP-1转染CNE2细胞对裸鼠致瘤的作用

目的研究反义LMP1基因转染CNE2细胞对裸鼠的成瘤作用。方法用反义LMP1转染的CNE2细胞、空载体转染的CNE2细胞以及原始CNE2细胞分别接种裸鼠,观察三种细胞的成瘤能力及细胞的恶性程度。结果反义LMP1转染的CNE2细胞比空载体转染的CNE2细胞及原始CNE2细胞在裸鼠体内成瘤能力(包括平均瘤重及总瘤重)和镜下细胞恶性程度都有所降低。结论反义LMP1能成功抑制LMP1的表达,逆转NPC细胞的恶性表型,为临床应用反义技术进行鼻咽癌基因治疗提供了实验依据。

SAA对鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响

目的观察血清淀粉样蛋白A(SAA)的超表达和抑制表达对鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响。方法体外培养SAA高表达的pcDNA3.1(+)-SAA-CNE2细胞系和干扰SAA表达的pGPU6/GFP/Neo-SAA-CNE2细胞系,两种细胞由课题组前期重组的SAA高表达pcDNA3.1(+)-SAA质粒及抑制SAA表达的pGPU6/GFP/Neo-SAA质粒分别转染构建。流式细胞仪分析以上两种细胞的细胞周期。平皿克隆实验检测细胞的增殖状况。结果流式细胞仪检测细胞周期显示SAA表达的增多可促进CNE2细胞分裂。平皿克隆实验显示SAA可使CEN2细胞的增殖能力增强。结论 SAA具有促进人鼻咽癌CNE2细胞增殖和体外迁移浸润的作用。

低强度超声对鼻咽癌CNE2细胞增值和凋亡的影响

目的:观察低强度超声对人鼻咽癌CNE2细胞增殖和凋亡的影响。方法:以低强度超声(频率1.7MHz,剂量1.35W/cm2)辐照CNE2细胞,采用MTT观察超声对COC1细胞增殖的抑制作用;光镜观察细胞形态,细胞核荧光染色法检测凋亡细胞。结果:超声波能够显著抑制鼻咽癌CNE2细胞增殖,辐照后孵育18h,其MTT光吸收值与对照组相比显著降低:光镜下可见细胞形态学改变,同时Hoechst33258荧光染色法观察到亮蓝色着染的凋亡细胞。结论:低强度超声辐照对人鼻咽癌CNE2细胞体外生长具有明显的抑制作用,并可诱导其凋亡。

17β-雌二醇对CNE2细胞κ阿片受体表达的抑制作用

目的：观察雌激素对κ阿片肽受体（κOR）mRNA含量和蛋白表达的调节作用．方法：采用半定量RT—PCR和Western blot方法，检测17β-雌二醇作用24～72h后CNE2细胞κOR mRNA含量和蛋白表达的变化．结果：17β-雌二醇（μmol／L）作用24h后，CNE2细胞表达κOR mRNA和蛋白明显降低，mRNA和蛋白含量分别下降到对照组的（49．2±7．66）％（P〈0．01）和（60．8±8．36）％（P〈0．01）；作用时间延长到48h后，CNE2细胞κOR蛋白含量为对照组的（32．9±7．13）％（P〈0．01）；而延长到72h后，κOR mRNA和蛋白含量分别下降到对照组的（20．8±7．71）％（P〈0．01）和（29．8±8．41）％（P〈0．01）．结论：雌激素能够从转录水平抑制κOR在CNE2细胞的表达．

二烯丙基二硫对人鼻咽癌CNE2细胞周期的阻滞作用

目的探讨二烯丙基二硫(DADS)对人鼻咽癌CNE2细胞周期的阻滞作用及分子机制。方法体外培养CNE2细胞,采用MTT比色实验、细胞计数法、细胞形态学观察、流式细胞仪和Western blotting方法分析DADS对CNE2细胞的增殖抑制作用、细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白p21WAF1的表达。结果MTT法显示,不同浓度DADS(90、140、240、400μmol/L)处理CNE2细胞48小时后,生长抑制率分别为3.3%、12.9%、28.3%、56.9%;细胞计数法表明,常规培养CNE2细胞群体倍增时间为24.5小时,DADS的浓度由90μmol/L增加到400μmol/L时,其细胞群体倍增时间由27.6小时延长到93.1小时;HE染色结果显示,不同浓度DADS处理CNE2细胞48小时后细胞异型性明显减少,核浆比例明显减少;流式细胞仪分析显示DADS呈浓度依赖性将CNE2细胞阻滞在G0/G1期;Western blotting分析表明,在细胞周期阻滞的同时有p21WAF1蛋白表达上调。结论DADS对CNE2细胞的抑制增殖作用与G0/G1期阻滞有关,其分子机制可能与调节p21WAF1表达有关。

ARA55过表达激活内源性线粒体凋亡通路诱导CNE2鼻咽癌细胞凋亡

目的:研究外源性ARA55表达上调对人CNE2鼻咽癌细胞生物学特性的影响,初步探讨相关作用机制。方法:实验设过表达组、空载体组及空白对照组。采用ZLip2000将前期构建的pCMV-ARA55-EGFP重组及空白载体分别转染至人CNE2细胞系,经荧光显微镜及Western blot进一步观察和鉴定过表达组中ARA55-EGFP融合蛋白的表达;通过设置细胞增殖、侵袭迁移及凋亡等系列实验,探讨ARA55在鼻咽癌中发挥的生物学功能;Western blot检测线粒体凋亡途径中系列蛋白的表达变化。结果:转染重组过表达质粒的CNE2细胞系中可检测到ARA55-EGFP融合蛋白的表达;体外细胞功能实验结果显示,ARA55蛋白过表达后,CNE2细胞的增殖受到抑制,体外迁移和侵袭的细胞数显著减少(P<0.05)。同时,凋亡相关实验结果显示,ARA55过表达组的细胞凋亡率(早期+中晚期)较空载体组显著升高(P<0.05);Western blot进一步证实ARA55过表达组中Bcl-2蛋白的表达下调,细胞色素C(Cytochrome C)表达明显增加,下游Caspase-9和Caspase-3的剪接体表达增加。结论:过表达外源性ARA55可诱导内源性线粒体凋亡通路的激活,从而抑制CNE2鼻咽癌细胞增殖,诱导凋亡。

山竹果皮中总氧杂蒽酮对人鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨山竹果皮中总氧杂蒽酮提取纯化物对人鼻咽癌CNE2细胞增殖及凋亡的影响及其作用机制。方法将人鼻咽癌CNE2细胞随机分成阴性对照组和不同浓度山竹果皮中总氧杂蒽酮提取纯化物组。阴性对照组不加药物,正常培养;总氧杂蒽酮提取纯化物组分别以200,400,600,800μmol·L-1总氧杂蒽酮作用24,48,72 h。采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度总氧杂蒽酮提取纯化物对CNE2细胞增殖的影响,Annexin-V/PI双重染色、碘化丙啶单染进行流式细胞术检测总氧杂蒽酮提取纯化物对CNE2细胞周期和凋亡的影响。Caspase-3试剂盒检测总氧杂蒽酮提取纯化物对CNE2细胞Caspase-3酶活化的影响。结果总氧杂蒽酮提取纯化物随着浓度增加,可显著抑制人鼻咽癌CNE2细胞的增殖活性,浓度为371.536 7μmol·L-1时可诱导人鼻咽癌CNE2细胞出现明显早期凋亡,并且随着药物作用时间的增加(24,48,72 h),凋亡早期癌细胞的比例显著上升(分别为0.03%,10.54%,26.47%)(P<0.05);总氧杂蒽酮提取纯化物使CNE2细胞G1期细胞比例大幅升高,同时S期细胞比例明显下降;对Caspase-3具有激活作用,Caspase-3酶的活性与药物浓度成正比。结论山竹果皮中总氧杂蒽酮提取纯化物对人鼻咽癌CNE2细胞增殖有显著抑制作用和促凋亡作用,其作用机制可能与抑制鼻咽癌细胞增殖活性、抑制细胞进入S期和激活Caspase-3有关。

CIK、DC-CIK细胞抗鼻咽癌CNE2细胞的作用比较

目的:研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)与树突状细胞(DC)共培养后DC-CIK细胞抗鼻咽癌CNE2细胞的作用。方法:正常人外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,加入CNE2细胞冻融液,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用MTT法测定杀伤活性。结果:DC-CIK细胞杀伤鼻咽癌细胞活性高于CIK细胞(P<0.05)。结论:DC-CIK细胞抗鼻咽癌CNE2细胞的作用显著,为DC-CIK细胞免疫治疗提供了实验和理论依据。

Smad 4基因在鼻咽癌CNE2细胞中的突变分析

目的:研究CNE2细胞中Smad4基因的突变。方法:运用RT-PCR方法从CNE2细胞中克隆人Smad4cDNA序列,然后与正常鼻咽组织及GenBank序列进行比较分析。结果:CNE2细胞中Smad4基因没有发生任何形式的突变。结论:CNE2细胞可能是一种非Smad4突变的恶性肿瘤,构建的含有人Smad4编码序列的重组质粒,为今后开展Smad4基因的功能研究奠定了基础。

双靶向性小分子酪氨酸激酶抑制剂ZD6474对鼻咽癌细胞株CNE2的放射增敏作用

目的研究ZD6474对鼻咽癌细胞株CNE2放射增敏作用。方法采用MTT法测定ZD6474的半数抑制浓度（50％inhibition concentration，IC50），克隆形成实验计算细胞存活率，拟合生存曲线计算放射生物学参数，流式细胞仪检测ZD6474联合放疗的凋亡率及细胞周期分布。结果单纯用药组，CNE2细胞的存活率随ZD6474浓度的增加而降低，其IC50约为2．15μmol·L^-1。ZD6474作用CNE2细胞24h后均见到放射增敏作用，增敏比为1．535±0．134。ZD6474或照射均可增加凋亡率，减少S期细胞比例及增加G2／M期细胞比例（P〈0．01）。结论ZD6474联合照射应用可提高cNE2细胞的放射敏感性并阻碍细胞增殖、促进凋亡和干扰细胞周期分布。ZD6474有望成为EGFR高表达CNE2细胞的放射增敏剂。

组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA抑制鼻咽癌CNE2细胞生长及对Skp2表达的影响

目的研究曲古抑菌素A(TSA)体外对鼻咽癌细胞CNE2的抑制作用及S期激酶相关蛋白2(Skp2)基因表达的影响,并探讨其作用机制。方法采用MTT法观察不同浓度TSA对CNE2细胞的生长抑制作用;采用RT-PCR分析TSA作用前后及不同TSA浓度下鼻咽癌细胞中细胞周期调控基因Skp2的表达。结果不同浓度的TSA对CNE2细胞有明显的生长抑制作用,并呈现一定的量效关系;同时,TSA可降低CNE2细胞Skp2的基因表达,且这种表达与剂量有一定关系。结论TSA能明显抑制CNE2细胞的增殖,其作用机制与细胞周期调控基因Skp2异常表达有关。