不同载体微球在p300与RORγt Co-IP实验效率的比较

目的:在免疫共沉淀(Co-IP)过程中使用Protein A/G-琼脂糖珠捕获蛋白和使用Protein A/G-磁珠捕获蛋白的比较分析。方法先通过共转染Flag-p300和Myc-RORγt质粒入人胚肾细胞系293T(HEK293T)进行过表达,裂解细胞制备蛋白,分别使用Protein A/G-琼脂糖珠捕获蛋白和使用Protein A/G-磁珠捕获蛋白进行Co-IP;再通过分离人脐血单个核细胞诱导分化人辅助性T细胞17(Th17)进行Co-IP比较分析;通过CCK8实验排除转染试剂等对细胞活性毒性。结果过表达的HEK293T细胞和诱导分化的Th17细胞中均显示腺病毒E1A结合蛋白(p300)与维甲酸相关孤儿核受体(RORγt)在Co-IP过程中使用Protein A/G-磁珠捕获大分子的p300蛋白效果好于中分子的RORγt蛋白,使用Protein A/G-琼脂糖珠捕获中分子的RORγt蛋白效果好于大分子的p300蛋白。结论在Co-IP过程中使用Protein A/G-磁珠捕获大分子蛋白效果较好,使用Protein A/G-琼脂糖珠捕获中分子蛋白效果较好。

浅析手游IP计中的应用研究

本文从手游IP在新式茶饮联名设计中的现状入手,分析手游IP在新式茶饮联名设计中的应用基础,对手游IP在新式茶饮联名设计中的应用规则进行细致的阐述,旨在更好地了解手游IP在新式茶饮联名设计中的未来发展趋势,认清IP联名的现状,归纳与总结IP联名的缺憾,实现跨圈双赢。

植物中验证蛋白相互作用的Pull-down和Co-IP技术

蛋白互作在细胞生命活动中发挥关键作用,在不同时空层面上参与多种细胞学过程,因此研究蛋白互作对理解分子调控网络至关重要。通常情况下,利用酵母双杂交系统筛选植物蛋白互作必须通过体外和体内系统进行验证。Pull-down和Co-IP是验证植物蛋白互作的常用技术。Pull-down被广泛用于体外验证蛋白间的直接互作;而在植物活体内,利用本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达蛋白,继而通过Co-IP进行鉴定是目前验证蛋白互作最简单且最有效的方法之一。该文对GST Pull-down和烟草瞬时表达系统中Co-IP技术原理及实验方案进行详细描述,以期为验证植物蛋白互作提供参考。

LUBAC介导RabGEF1的线性泛素化修饰

目的验证RabGEF1(Rab guanine nucleotide exchange factor 1)为线性泛素化修饰的新底物。方法在pEF6/MycHis C载体中克隆人RabGEF1基因。通过免疫共沉淀(Co-IP)实验验证RabGEF1和HOIP的相互作用。利用GST-pulldown实验探索RabGEFl与HOIP相互作用结构域。通过免疫荧光实验验证RabGEF1和HOIP的相互作用与亚细胞定位。应用体内泛素化实验检测RabGEF1的线性泛素化修饰。通过NTA-His泛素化实验进一步明确RabGEF1能够发生线性泛素化修饰。将RabGEF1的泛素化蛋白质样品进行质谱分析,根据质谱结果提示的RabGEF1泛素化位点构建赖氨酸位点突变质粒,进一步在体内泛素化实验中验证RabGEF1的线性泛素化修饰位点。结果RabGEF1与HOIP存在相互作用,且HOIP通过ZF-NEF结构域与RabGEF1发生直接相互作用。RabGEF1与HOIP共同定位于细胞质。LUBAC介导RabGEF1发生线性泛素化修饰依赖于LUBAC酶活性,RabGEF1泛素化修饰位点为K158。结论RabGEFl为线性泛素化修饰的新底物,且K158是其发生线性泛素化修饰的位点。

肝癌细胞中VIPR1互作蛋白质谱分析及肝癌预后模型的构建

目的:寻找与血管活性肠肽受体1(vasoactive intestinal peptide receptor 1,VIPR1)相互作用的蛋白并构建肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)预后模型。方法:采用免疫共沉淀技术(Co-immunoprecipitation,Co-IP)筛选Flag标签抗体结合的蛋白复合体,采用SDS-PAGE银染实验和Western blot进行验证,采用质谱分析(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)获得VIPR1的互作蛋白,采用生物信息学软件和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas project,TCGA)数据库筛选hub互作蛋白、富集分析、构建HCC预后模型并采用国际癌症基因组联盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)中LIHC数据和GSE14520数据集作为外部数据对其预测准确性进行验证。结果:得到196个VIPR1的互作蛋白,筛选出8个关键模块共104个hub互作蛋白,主要与细胞骨架、核糖体的功能和细胞免疫密切相关,获得7个关键蛋白并构建了HCC预后Lasso回归模型,随后在两个外部数据集中验证了该模型在预测HCC预后方面具有可接受的准确性及临床适用性。结论:VIPR1的互作蛋白可促进HCC发生发展,其中关键蛋白构建的HCC预后模型有良好的准确性。

基于价值共创的餐饮IP赋能乡村旅游设计策略研究——以乐山苏稽古镇跷脚牛肉为例

“美食+旅游”已成为发展乡村旅游产业的重要模式,本文以地域特色的餐饮文化为着力点,为餐饮IP赋能乡村旅游产业发展探索适宜路径。基于现有社会品牌实践验证旅游发展与IP的关联性,并引入价值共创理论探析IP赋能乡村文旅产业的可能性。通过对苏稽跷脚牛肉主题小镇进行实地考察,构建用户旅程图与商业画布,分析小镇价值共创体系现存问题,提出适宜办法。架构以建立品牌IP为宣传主体的乡村旅游产业价值共创体系,并提出相关发展策略,以此设计出一套苏稽跷脚牛肉主题小镇IP的价值体系为理论提供实践支撑,为餐饮IP同乡村旅游产业发展提供系统化范式。随着数字信息时代的发展,旅游产业的宣传主体液态化致使宣传手段更加多元,对城市与乡村特色餐饮IP产业进行研究有助于推动线上宣传的可视化与直观化,可为乡村振兴提供良性影响。

流感病毒NP蛋白与宿主蛋白SNRPA的相互作用研究

流感病毒核蛋白(NP)是由病毒RNA节段5编码的主要结构蛋白,与病毒基因组RNA及聚合酶(PB1、PB2、PA)构成核糖核蛋白(vRNP)复合体,是病毒基因组的转录和复制的基本功能单位。本实验室采用酵母双杂交技术从人细胞系cDNA文库中筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主蛋白U1 small nuclear ribonucleoprotein A(SNRPA)。本研究通过酵母回交验证、免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull down试验进一步证实NP与SNRPA之间存在直接相互作用。利用siRNA干扰基因的表达后,流感病毒的复制滴度在24 h和48 h分别下降2.7倍和1.75倍,表明SNRPA蛋白表达对流感病毒的复制发挥正调控作用。本研究丰富了流感病毒蛋白与宿主蛋白之间的蛋白质调控网络,为进一步研究流感病毒复制调控的机制奠定了基础。

组蛋白乙酰化酶调控MSCs经5-azaC诱导后的细胞周期和增殖特性

目的阐述组蛋白乙酰化酶GCN5在间充质干细胞(MSC)经5-氮杂胞苷(5-azaC)诱导过程中的作用及其转录调控机制。方法 MTT法、流式细胞术检测细胞周期和细胞增殖;定量PCR检测P21基因表达;CH IP技术验证GCN5募集蛋白复合体与P21基因的相互作用及P21基因启动子区域的乙酰化水平;Co-IP技术分离、串联质谱技术鉴定GCN5募集蛋白复合体组成。结果 MSCs经5-azaC诱导3 d后,G0/G1期细胞比例、P21基因表达量最高,此后逐渐降低,细胞增殖指数及G2/S期细胞比例与上述结果相反;筛选出GCN5募集蛋白复合体为:依赖ATP的染色质重塑复合体成分、转录起始复合体成分、转录因子和锌指结构蛋白;诱导组GCN5与P21基因启动子区域结合能力及P21基因启动子区域组蛋白H3乙酰化水平高于未诱导组。结论 GCN5募集蛋白复合体通过结合于P21基因启动子区域参与调控MSCs经5-azaC诱导体外分化过程中细胞周期G0/G1期和细胞增殖特性的调控。

服装品牌IP联名现象以及在服装设计上的应用

随着中国经济快速发展,服装行业作为一个日新月异的行业,为最大限度地获得消费者的青睐,每季都会涌现大量新品。由于“90后”“00后”逐渐成为中国新生代消费主力,服装的功能性已不能满足这些拥有独立审美、勇于接受新事物的年轻群体,精神层面逐渐成为他们消费的原因之一。近年来,各大服装品牌IP跨界联名的现象层出不穷,但有时过度商业化也导致服装品牌不愿集中精力在设计本身推陈出新,更愿意走捷径获得“流量”,甚至联名的两个品牌本身的精神理念相去甚远,让人不禁怀疑是否在大量消耗联名品牌或艺术品的价值。文章以Jack Jones和NBA、Coach和艺美国艺术家Jean-Michel Basquiat两个联名为正反两例(笔者参与前者项目),分析了目前市场上IP跨界联名现象。

IP联名助力下国内女装品牌转型设计研究

随着疫情的结束,我国女装市场规模整体呈上升趋势,这对女装市场的要求不断提高。加上当代女性对服装更加多元化的需求,国内女装品牌面临着产业升级、品牌转型等问题。通过品牌IP联名的方式可以助力服装品牌实现产业整合升级,赋予品牌更多内在价值。文章通过列举和分析案例的方法,调研分析不同品牌联名形式的优劣势,总结了IP联名存在盲目跟风、丢失品牌文化、缺少创新等问题,提出了IP联名助力国内女装品牌升级与转型的策略,为服装品牌展开IP联名合作提供了更多的创新思路。

全反式视黄酸通过RARγ蛋白直接调控PPARγ2蛋白抑制骨髓间充质干细胞成脂分化

目的研究高浓度全反式视黄酸(atRA)抑制大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)成脂分化过程中,视黄酸核受体γ(RARγ)对过氧化物酶体增殖激活受体γ2(PPARγ2)与CCAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)调控的机制。方法体外分离、培养、诱导r BMSCs。成脂分化诱导液中,加入0.5、1.0μmol/L atRA持续作用15 d后,real-time PCR和Western blotting分别检测RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA和蛋白表达水平。重组腺病毒过表达RARγ(over-RARγ)、沉默RARγ(si-RARγ)分别感染BMSCs,采用real-time PCR及Western blotting检测RARγ、C/EBPα、PPARγ2的mRNA及蛋白表达水平。Co-IP检测1.0μmol/L atRA持续成脂诱导15 d后,明确RARγ与PPARγ2两者之间是否有相互作用。结果诱导15 d结束时,与对照组相比,加入0.5、1.0μmol/L atRA后,RARγ表达明显增加(P<0.01,P<0.001),而PPARγ2、C/EBPα表达明显降低(P<0.001)。over-RARγ组:RARγmRNA和蛋白表达均较对照组明显增加(P<0.01),而PPARγ2、C/EBPαmRNA和蛋白表达均较对照组明显降低(P<0.05,P<0.01)。si-RARγ组:RARγ蛋白表达较对照组明显减低,但PPARγ2、C/EBPα却无明显变化。Co-IP结果提示:RARγ与PPARγ2蛋白之间有直接作用,形成复合物,未发现其与视黄酸反应元件(RARE)相结合证据。结论高浓度atRA抑制r BMSCs成脂分化,是通过激活视黄酸信号通路RARγ而实现的。RARγ下调成脂分化通路PPARγ2、C/EBPα表达是通过直接作用于下游的PPARγ2蛋白而实现的。

伪狂犬病病毒UL56蛋白与宿主蛋白Nedd4相互作用的研究

伪狂犬病病毒(PRV)UL56蛋白(pUL56)属于Ⅱ型膜蛋白。近期研究结果表明PRVpUL56与PRV对啮齿动物的致病性相关。为揭示PRVpUL56与宿主相互作用的分子基础,本研究通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定了pUL56与神经前体细胞表达的发育下调蛋白4(Nedd4)存在相互作用。进一步,利用激光共聚焦试验确定过表达pUL56与Nedd4在转染HEK293T细胞的高尔基体存在共定位。通过互作,pUL56可以将细胞质分布的Nedd4重新定位于高尔基体。前期研究表明,含有WW结构域的宿主蛋白可以与含有PPxY(PY)基序的病毒蛋白互作。因此,本研究构建了pUL56PY基序丙氨酸突变体(PPxY/AAxY),利用Co-IP试验对pUL56突变体和Nedd4相互作用进行验证,结果表明随着pUL56PY基序突变的增加,蛋白互作能力逐渐减弱。此外,pUL56通过其PY基序显著下调Nedd4的表达。这些结果证实了PRVpUL56与Nedd4主要通过WW结构域/PY基序模式发挥相互作用,并下调Nedd4的表达。因此,本研究为阐明PRVpUL56与宿主相互作用的分子机制提供了参考依据。

基于跨媒体叙事的国产游戏联名服装设计路径研究

近年来出现了许多时尚品牌与国产电子游戏的跨界联名服装,为探究国产游戏联名服装设计路径的创新,本文采用跨学科研究法,分析跨媒体叙事理论与国产游戏联名服装设计的关联,基于跨媒体叙事探讨国产游戏联名服装的设计路径创新。通过研究,本文总结出跨媒体叙事与国产游戏联名服装在基本概念、营销方式、产品开发等方面的契合性,基于跨媒体叙事理论确立了建立联名、协商定位、设计服装、投入销售的游戏联名服装设计路径,并提出建立用户参与互动有助于优化服装设计,从新的视角丰富国产游戏联名服装的设计方法,提高联名服装的叙事性。

室内香烟烟雾动态变化规律的实验研究

本文作者为探明被动吸烟者的实际暴露水平,在实验小室内以IP和CO为指标,对多种吸烟状况进行了连续、自动监测。结果表明,室内香烟烟雾有一个随时间变化而增长和衰减的过程,影响香烟烟雾的主要因素为吸烟量、室内容积和室内通风换气率。

浅谈SoC设计中的软硬件协同设计技术

集成电路制造技术的迅速发展已经可以把一个完整的电子系统集成到一个芯片上即所谓的系统级芯片 (Sys tem on Chip ,简称SoC)。传统的设计方法是将硬件和软件分开来设计的 ,在硬件设计完成并生产出样片后才能调试软件。本文介绍了针对于系统级芯片设计的软硬件协同设计技术 (co design)的概念和设计流程 。

暹罗炭疽菌中脂滴包被蛋白Cap20与乙酸激酶CsAck的互作研究

暹罗炭疽菌(Colletotrichum siamense)是一种重要的病原真菌,是我国橡胶树炭疽病(Colletotrichum leaf disease,CLD)的田间优势病原种,也是热带、亚热带地区许多其他农林作物炭疽病的主要病原种。脂滴是细胞的中性脂,存在于绝大多数真核细胞中,是细胞内甘油三酯的主要贮存形式。脂滴在细胞内可以参与脂质代谢、膜转运、蛋白降解和信号传导等。包被蛋白(perilipin)是脂滴表面最丰富的脂质相关蛋白,主要存在于动植物体内,对细胞内脂滴代谢起着重要的调控作用。Cap20是暹罗炭疽菌中包被蛋白的同源蛋白,前期证实Cap20是一个致病相关蛋白,它参与了炭疽菌附着胞膨压形成、脂滴数量和致病性。了解其互作蛋白和互作的生物学意义可能为深入了解脂滴包被蛋白参与的致病分子机制具有重要意义。课题组前期通过酵母双杂交技术在暹罗炭疽菌cDNA文库中筛选到一个与Cap20互作的候选蛋白乙酸激酶,本研究克隆了该乙酸激酶的编码基因,并进行了蛋白结构和同源蛋白聚类分析。结果表明,乙酸激酶编码基因的DNA大小为1312 bp,包括一个内含子,cDNA为1248 bp,编码415个氨基酸,含有一个乙酸激酶结构域,命名为CsAck。然后构建含6×his标签的原核表达载体PET32a-CsAck,利用其和含GST标签的pGEX6p-1-Cap20(先前构建)进行蛋白表达和纯化,获得含有6×His标签的融合蛋白CsAck和含有GST标签的Cap20。通过Pull down验证了Cap20和CsAck蛋白之间的体外互作。最后,构建含有潮霉素转移酶基因HPH的表达载体PXY203-CsAck-S和含有氯嘧磺隆抗性基因ILV1的表达载体pCB1532-GFP-Cap20,将它们共同转化暹罗炭疽菌野生型菌株获得转化子。Co-IP(Co-immunoprecipitation)的结果证实Cap20和CsAck在暹罗炭疽菌中可以相互作用。该结果证实了致病性相关蛋白Cap20和乙酸激酶CsAck在体外和体内均可发生蛋白互作,可为进一步研究Cap20在暹罗炭疽菌中的致病功能和调控机制奠定基础。

猪PKM2基因在肺炎支原体感染3D4/21细胞后的互作蛋白质鉴定与分析

通过构建含有HA标签的PKM2过表达质粒转染3D4/21细胞,利用免疫共沉淀(Co-IP)与液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术分析与鉴定猪PKM2基因在肺炎支原体感染猪肺泡巨噬细胞3D4/21后的互作蛋白质,并对这些互作蛋白质进行GO与KEGG通路分析。结果显示肺炎支原体感染3D4/21细胞后,PKM2在mRNA水平和蛋白质水平上表达上调,其表达水平呈现剂量与时间依懒性。免疫共沉淀反应结果显示IP与IgG组共鉴定到72个蛋白质,这2组鉴定到的蛋白质数分别为60和19,其中7个蛋白质在2组中同时鉴定到。GO分析结果表明IP组的互作蛋白质主要参与了NAD代谢过程、NADH代谢过程、肌原纤维组装、NADH再生和葡萄糖代谢丙酮酸等生物过程,其中大多数与能量代谢有关。KEGG pathway分析结果表明互作蛋白质参与了致病性大肠杆菌感染、军团杆菌病、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢和癌症中的中枢碳代谢等通路,这些通路与细菌感染和能量代谢有关。

GALNT14与MT2A相互作用验证

利用免疫共沉淀(Co-IP)和蛋白沉降实验(GST pull-down),分别从体内外对N-乙酰氨基半乳糖转移酶(GALNT14)与金属硫蛋白2A(MT2A)之间的相互作用进行了验证.将MT2A全长c DNA片段克隆到p ET-Dsb A和p CMV-Myc载体上.表达并纯化了His-Dsba-MT2A和GST-GALNT14蛋白,在体外通过GST pulldown技术分析,显示MT2A能与GALNT14结合,证实了二者在体外的直接相互作用.继而,共转染p CMVMyc-MT2A和p CDNA3.1-Flag-GALNT14到人乳腺癌细胞株MCF-7中,通过免疫共沉淀实验发现抗Myc抗体可以将GALNT14从细胞裂解液中沉淀下来,证实了它们在胞内的相互作用.结果显示了GALNT14和MT2A在体内外条件下能够发生直接相互作用,这为进一步明确GALNT14的功能及作用机制奠定了基础.

RIG-G基因在酵母双杂交后的蛋白互作验证

RIG G基因是利用全反式维甲酸(ATRA)诱导,采用差异显示PCR方法从APL细胞系NB4中克隆到的一个新基因.采用酵母双杂交的方法筛到了与RIG G发生相互作用的JAB1.由于在酵母这种低等真核细胞中缺少诸如高等真核细胞中各种保证蛋白正常生物学功能发挥所必需的翻译后修饰,这种方法筛到的阳性克隆并不一定代表了真实的作用,所以在COS7细胞中采用了CO IP(co immunoprecipitation)实验,间接法、直接法均证实了这种相互作用.

人脑中硒蛋白W与鞘脂激活蛋白原相互作用的筛选与验证

硒蛋白W(SelW)是人脑中一种重要的硒蛋白.在缺硒的条件下,SelW在脑中具有优先储备的特性,但其具体机制和在脑中的功能至今尚不清楚.本文以SelW突变体SelW′为"诱饵",采用酵母双杂交系统对人胎脑文库进行筛选,获得与SelW相互作用的蛋白,其中一种为鞘脂激活蛋白原(PSAP).采用荧光共振能量转移技术中的受体漂白和敏化发射两种方法,验证了SelW与PSAP的相互作用.构建表达载体在大肠杆菌中成功表达出SelW′,利用Pull-down技术验证了SelW′与PSAP在细胞外的直接相互作用.采用免疫共沉淀的方法验证了上述两种蛋白在昆明小鼠脑组织中的内源性相互作用.基于SelW和PSAP的已知生物功能,推测SelW可能在脑部发育和神经退行性疾病形成过程中发挥着重要作用.