传染性胰腺坏死病毒VP2 COE蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

为制备抗IPNV VP2蛋白的单克隆抗体,对其基本特性进行鉴定并进行初步应用。实验利用Ni-NTA亲和层析纯化的IPNV VP2 COE重组蛋白作为免疫原,免疫8周龄的雌性BALB/c小鼠,经3次免疫后,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合。采用间接ELISA和有限稀释法筛选杂交瘤细胞,共得到2株能稳定分泌特异性抗体的阳性细胞株,分别命名为5G10和5F3,亚类鉴定均为IgG1亚类。2株杂交瘤细胞的染色体数目在75～120之间。间接ELISA检测5G10和5F3细胞培养上清的效价分别为1∶105、1∶102,腹水效价分别为1∶108、1∶104。Western-blotting和间接免疫荧光鉴定结果显示,2株单抗均能特异性地识别IPNV。间接ELISA表明,2株单抗不与IHNV、VHSV、SVCV、HRV等病毒反应,说明获得的单抗具有高度的特异性。相加ELISA实验结果显示,2株单克隆抗体分别识别IPNV VP2蛋白上不同的抗原位点。应用间接免疫荧光方法对临床确定为患有IPN虹鳟肝组织进行检测,结果证实该2株单克隆抗体可用于后续实验。

猪流行性腹泻病毒COE抗原表位的原核表达及鉴定

为更好地了解近年来仔猪流行性腹泻疫情,收集上海地区猪流行性腹泻病猪的临床样品,扩增猪流行性腹泻病毒保护性抗原基因(COE基因),构建原核表达载体pColdⅡ-COE,转化至大肠埃希菌pGTf2/BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE结果显示,表达的COE蛋白大小为16ku,Western blot分析表明,该蛋白与临床上猪流行性腹泻病毒阳性猪的血清有特异性反应,说明所表达的COE蛋白具有反应原性,为进一步研制猪流行性腹泻疫苗和ELISA检测方法奠定了基础。

猪流行性腹泻病毒coe基因的克隆表达及卵黄抗体的制备

通过RT-PCR技术扩增猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)coe基因,将其克隆至原核表达载体p ET32a中,构建重组表达质粒p ET32a-coe,鉴定正确后进行诱导表达。结果表明,重组菌可表达相对分子量约为33 k D的融合蛋白;Western-Blotting结果显示,COE蛋白能与抗PEDV的阳性血清发生特异性结合反应,表明研究的COE蛋白具有良好的反应原性。纯化后的COE蛋白与弗氏佐剂按比率混合作为免疫抗原,免疫产蛋鸡,获得特异性抗猪流性腹泻病毒COE蛋白的卵黄抗体(Ig Y)。氯仿抽提法提取卵黄抗体,通过SDSPAGE、Western-Blotting对提取的卵黄抗体进行鉴定并用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)对其进行效价检测。结果显示,纯化后的卵黄抗体Ig Y具有高度的特异性,其抗体效价可达1∶1 000。研究结果表明,表达的COE蛋白具有良好的免疫原性,作为免疫抗原制备的卵黄抗体具有较高的抗体效价。

传染性胰腺坏死病病毒分离株VP2基因抗原表位区融合表达及免疫特性的分析

利用RT-PCR方法扩增出IPNV-ZYX分离株主要结构蛋白VP2的抗原表位区基因(616bp),命名为IPNV VP2 COE,将其克隆到pCold TF表达载体中构建重组质粒pCold TF-VP2COE,在大肠杆菌BL21(DH5α)感受态表达,经SDS-PAGE电泳分析,表达蛋白约78 ku,用镍离子亲和层析柱纯化该蛋白,制备抗血清,间接ELISA结果显示,IPNV(ATCC VR-1318)细胞培养物与鼠抗VP2 COE蛋白血清发生特异性反应,效价为1∶12 800;间接免疫荧光结果显示,鼠抗VP2 COE血清可与黑龙江某渔场已知感染IPNV虹鳟肝组织产生特异性的荧光,以上两项结果表明,表达IPNV VP2 COE蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,为IPNV检测方法的建立及疫苗的制备提供理论依据。

焦炉工人血清p53蛋白表达及影响因素分析

目的检测职业接触焦炉逸散物的焦炉工人血清p53蛋白的表达情况,探讨p53蛋白作为焦炉工早期筛查肺癌指标的意义。方法运用免疫印迹技术(Western-blot)对118名接触组工人和50名对照组人群进行血清p53蛋白检测。比较接触组和对照组的血清p53蛋白水平,分析影响血清p53蛋白水平的因素。结果接触组不同工龄组之间p53蛋白的表达水平差异有统计学意义(P<0.05),且随着工龄的增加,p53蛋白的表达水平增加;导致血清p53蛋白水平升高的主要危险因素是炼焦工种及工龄。结论经常大量接触焦炉逸散物可使p53蛋白表达水平升高,可能增加了p53基因异常的危险性,从而使焦炉工得肺癌的危险性增加。

猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】建立2种猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体间接ELISA检测方法.【方法】分别以GD-1株PEDV灭活全病毒和原核表达的COE融合蛋白作为包被抗原,确定最佳ELISA条件,检验其重复性、特异性等,并进行临床应用.【结果和结论】确定了2种ELISA方法的最佳条件,重复性试验显示变异系数分别小于4.60%和5.30%,特异性试验检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性,并具有良好的稳定性和较长的保存期.临床样品检测结果显示,223份血清样品总阳性率分别为97.3%(217/223)和98.6%(220/223),2种方法检测的阳性率相近,具有良好的检出率和很高的符合率,为PEDV的抗体检测及流行病学调查提供了一种技术手段.

焦炉作业工人血浆热应激蛋白70kD抗体滴度及肿瘤坏死因子水平的研究

为探讨焦炉逸散物及高温对作业工人血浆HSP70抗体滴度及肿瘤坏死因子（TNF）的影响，运用酶联免疫吸附鉴定法检测了85名焦炉工和73名非焦炉工血浆HSP70抗体滴度和TNF－α的含量。结果显示，焦炉工有51人出现1：10抗体阳性，21人出现1：20抗体阳性，分别占60％、28．2％；非焦炉工有23人出现1：10抗体阳性，11人出现1：20抗体阳性，分别占31．5％、15．1％，两组相比，差异有显著性（P＜0．05）。TNF的含量焦炉组明显高于对照组，差异有显著性（P＜0．05）。结果表明，焦炉逸散物和高温可导致机体受损、免疫功能发生紊乱。

镰孢霉疫苗表达系统的构建及优化

镰孢霉(Fusarium venenatum)是一种具有高效表达和分泌蛋白质潜力的丝状真菌.本文探索以镰孢霉为表达宿主建立真菌蛋白表达系统.以含有Hyg抗性的pFGL59为出发质粒,分别利用真菌宿主里常用的强启动子PgpdA、PglaA和Ptrypsin构建整合型蛋白表达载体,并通过表达猪流行性腹泻病毒的中和表位蛋白COE,检测该系统的表达效率.通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对工程菌株的胞外蛋白进行分析检测,结果显示在启动子Ptrypsin的驱动下,COE蛋白在镰孢霉工程菌中高效表达并分泌到胞外,而含有启动子PgpdA和PglaA的工程菌胞外蛋白中未检测到COE蛋白.根据镰孢霉密码子偏好性对coe基因的密码子进行优化后,COE蛋白在镰孢霉中的表达量得到显著提高.该疫苗表达系统的构建为疫苗蛋白在真菌宿主里的异源表达提供了新的方向.

焦炉工血清p53蛋白的检测分析

目的探讨职业接触焦炉逸散物的焦炉工人血清p53蛋白的表达水平及其在肺癌高危人群筛检中的意义。方法运用蛋白质印迹技术(W esternb lot),对接触组118例和对照组50例人群的血清p53蛋白进行检测,比较两组血清p53蛋白的表达水平。结果接触组不同工龄组、不同作业地点间p53蛋白的表达水平具有统计学意义(P<0.05)。结论经常大量接触焦炉逸散物可使p53蛋白的表达水平升高,增加p53基因异常的危险性,从而使焦炉工患肺癌的危险性增加。

猪流行性腹泻病毒COE蛋白原核表达及其反应原性的初步鉴定

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)的优势抗原表位COE可溶性原核表达及其反应原性,试验采用RT-PCR方法扩增出COE基因,将其克隆至原核表达载体p MAL-C5X上,构建重组质粒p MAL-C5X-COE,经测序鉴定正确后转化Rosetta感受态细胞,并进行IPTG诱导表达和Westernblot验证。结果表明:重组菌p MAL-C5X-COE表达的融合蛋白MBP-COE的分子质量约为57 ku,优化的诱导条件为IPTG浓度0.8 mmol/L、诱导时间4 h,诱导温度30℃,重组蛋白以可溶性蛋白形式存在于菌体中,融合蛋白与兔抗PEDV多克隆抗血清发生特异的免疫印迹反应。说明原核表达的COE融合蛋白可溶且具有良好的反应原性。

2016—2019年山东省仔猪腹泻病原调查及PEDV分离株S基因遗传进化分析

本研究于2016年6月至2019年3月从山东省部分地区收集了231例疑似猪流行性腹泻(PED)病猪样品,患病仔猪主要临床症状为发热、呕吐、水样腹泻、体质量减轻和脱水,并有较高的病死率。通过PCR/RT-PCR对样品进行相关腹泻病原检测。检测结果显示,猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性病料147份,阳性率为63.63%;猪圆环病毒2型(PCV2)检出率为16.88%(39/231);猪轮状病毒(PoRV)检出率为5.19%(12/231),猪传染性胃肠炎(TGEV)检出率为0.43%(1/231)。本研究分离到7株PEDV,对其S基因序列进行遗传进化分析,结果显示,分离株与PEDV参考株的核苷酸序列同源性为93.1%~98.9%,氨基酸序列同源性为91.5%~98.7%。分离株与疫苗株CV777有不同程度的核苷酸和氨基酸位点突变,部分突变氨基酸位点位于PEDV抗原表位区域(COE)和抗原表位S1D5、S1D6中。本研究结果表明vPEDV在山东省广泛流行,是引起仔猪腹泻的主要病原因素,研制新型PEDV疫苗已迫在眉睫。