重组Tet-on COLIA1基因腺病毒骨组织靶向表达对大鼠骨质疏松骨折愈合生物力学影响的实验研究

目的:研究重组Tet-on COLIA1基因腺病毒骨组织靶向表达对大鼠骨质疏松骨折愈合生物力学的影响。方法:40只健康雌性大鼠按照随机数字表法分为手术组(n=36)和假手术组(n=4)。手术组大鼠切除双侧卵巢,建立骨质疏松动物模型。假手术组大鼠仅切开皮肤,不切除双侧卵巢。手术组36只大鼠切除双侧卵巢3个月后,随机选取4只并处死,同时处死假手术组4只大鼠。收集其胫骨标本,采用双能X线测量假手术组和手术组大鼠的骨密度,以证实大鼠骨质疏松模型建立成功。随后,将剩余的32只手术组大鼠,采用薄电锯片从胫骨中段横行切断骨干,克氏针固定骨折断端,以构建大鼠骨质疏松骨折模型。同时按照随机数字表法分为4组:A组,重组Tet-on COLIA1基因腺病毒+强力霉素组;B组,重组Tet-on COLIA1基因腺病毒;C组,Tet-on空白腺病毒+强力霉素组;D组,空白对照组。分别于注射腺病毒6、8周后在电子万能材料试验机上进行胫骨三点弯曲试验。根据载荷-变形曲线计算骨折标本的生物力学参数,包括最大负荷、弹性模量、屈服点最大应力,同时采用micro-CT检测骨折愈合情况。结果:术后3个月手术组大鼠胫骨骨密度低于假手术组大鼠,且差异有统计学意义(P=0.005),表明大鼠骨质疏松模型制备成功。胫骨三点弯曲试验发现A组大鼠的最大负荷、弹性模量、屈服点最大应力,在腺病毒转染6、8周后,均高于B、C、D三组大鼠,且差异均有统计学意义(P<0.05)。Micro-CT显示,在转染6、8周后,A组大鼠骨折断端更加模糊,骨皮质较连续,骨折断端愈合更好。结论:经重组Tet-on COLIA1基因腺病毒转染的骨质疏松骨折大鼠,在强力霉素的作用下,能增加大鼠的最大载荷、弹性模量、屈服点最大应力,改善骨折愈合的能力,缩短骨折愈合的时间。

成都地区骨质疏松症患者骨密度与Ⅰ型胶原α_1链基因Sp1结合位点多态性的相关性研究

目的探讨Ⅰ型胶原α1链（COLIA1）基因Sp1结合位点的多态性与成都地区骨质疏松症患者骨密度的相互关系。方法（1）选取四川大学华西医院门诊骨质疏松症患者中合格的自愿受试者237例，应用双能X线吸收法测定其第2-4腰椎（L2-L4）部位的骨密度值；（2）抽取受试者外周静脉血2ml，提取白细胞基因组DNA；（3）采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的基因所在的DNA片段（第1112-1328核苷酸之间的片段，扩增产物长度为217 bp）；（4）应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法检测外周血白细胞基因组COLIA1基因Sp1结合位点多态性，扩增产物经限制性内切酶Van91I（pflMI）酶切，琼脂糖凝胶电泳观察，有酶切位点用S基因表示，无酶切位点用S基因表示。结果237例受试对象中，所有标本的扩增片段都能被限制性酶识别并切开，未能观察到Ⅰ型胶原α．链Sp1结合位点G→T突变，COLIA1基因型均为野生纯合子SS型，未发现SS基因型和SS基因型。结论在成都地区部分汉族骨质疏松症患者中，未发现COLIA1基因Sp1结合位点的多态性，其腰椎骨密度可能与Ⅰ型胶原α，链基因Sp1结合位点多态性无关。

汉族人和法国人Ⅰ型胶原α链Spl结合序列MscⅠ酶切位点基因多态性的比较

目的 了解中国汉族人和法国人Ⅰ型胶原α链Spl结合序列MscⅠ酶切位点基因多态性分布的异同。方法 对 96例中国汉族人和 78例法国人用DXA骨密度仪进行BMD测量 ,同时采集全血并抗凝保存。用聚合酶链式反应、限制性酶切技术对Ⅰ型胶原α链Spl结合序列基因型进行分析。结果 96例汉族人的基因型均为SS ,78例法国人的基因型为 5 3例SS、2 2例Ss和 3例ss,经Fisherχ2 检验 ,显示差异有非常显著性 (P <0 0 1)。结论 汉族人和法国人的Ⅰ型胶原α链Spl结合序列MscⅠ酶切位点基因多态性显著不同。汉族人Ⅰ型胶原α链Spl结合序列MscⅠ酶切位点稀少。

Ⅰ型胶原蛋白多态性与脊柱融合的相关性分析

目的研究Ⅰ型胶原蛋白(COLIA1)基因的多态性与脊柱融合患者术后融合效果的相关性。方法抽取需行脊柱融合患者外周静脉血3 mL,提取白细胞DNA并扩增目的基因所在的DNA片段;用PCR-RFLP检测外周血白细胞基因组CO-LIA1基因Pcol2位点多态性,扩增产物经限制性内切酶Eco31Ⅰ酶切,琼脂糖凝胶电泳观察;对照术前及术后3、6、12个月的X线片,观察植骨融合情况。结果两组实验对象均存在COL1A1基因Pcol2位点-1997G/T多态性,GG型166例,GT型232例,TT型25例。并发现GG基因型与颈椎融合有相关性(P=0.004),而与腰椎后路横突间植骨融合无相关性(P=0.831)。结论 COLIA1 Pcol2位点-1997G/T单核苷酸多态性GG基因型可能是促进颈椎前路自体髂骨植骨融合的重要遗传基因。

COLIA1 Sp1基因多态性与中国汉族老年性椎间盘退化的相关性研究

目的研究Ⅰ型胶原蛋白α1(COLIA1)基因Sp1位点基因多态性与中国汉族老年性椎间盘退化的相关性。方法以65岁以上汉族老年人为研究对象,375例中国汉族椎间盘退变疾病患者(病例组)与118例中国汉族非椎间盘退变疾病受访者(对照组),PCR检测COLIA1基因第一个内含子Sp1位点G→T多态性。检测病例组和对照组间等位基因频率/基因型分布频率的差异。结果对照组和病例组一般人口学特征差异无统计学意义,两组COLIA1基因Sp1位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡;对照组和病例组中基因型分布频率分别为GG:264(70.4%)/82(69.5%)、GT:102(27.2%)/26(22.0%)、TT:9(2.4%)/10(8.5%),两组差异具有统计学意义(χ2=9.527,P=0.009);等位基因频率分别为G:630(84.0%)/190(80.5%)、T:120(16.0%)/46(19.5%),差异无统计学意义(χ2=1.563,P=0.211)。结论 COLIA1Sp1基因多态性可能是中国汉族老年椎间盘退化的遗传危险因素。

四个成骨不全家系COL1A1及COL1A2基因的突变分析

目的分析4个成骨不全家系致病基因COL1A1、COL1A2基因致病突变位点，为家系遗传咨询和产前诊断提供依据。方法应用二代测序对4个成骨不全家系的先证者COL1A1、COL1A2基因编码区进行外显子检测，获得变异序列后，针对所检出变异序列经PCR扩增后进行Sanger双向测序，对4个成骨不全家系中4例先证者及其家系成员和200名正常个体的COL1A1、COL1A2基因序列进行变异验证分析，确定致病突变后，对1个家系中的高危胎儿进行产前诊断。结果家系1和2先证者分别携带COL1A1基因C．760G〉A（P．Gly254Arg）、C．608G〉T（P．Gly203Val）杂合突变，父母均未携带该突变；家系3先证者和先证者女儿均携带COL1A1基因c．299-1G〉C杂合突变，先证者妻子未携带该突变；产前诊断结果显示家系3胎儿未携带与先证者相同的突变，与B超影像结果一致。家系4先证者携带C0L1A2基因c．1990G〉C（p．Gly664Arg）杂合突变，父母均未携带该突变；200名正常个体未检测到上述突变。其中COL1A1基因C．299-1G〉C和COLJA2基因C．1990G〉C（p．Gly664Arg）突变为未报道过的新突变。结论COL1A1、COL1A2基因突变是这4个成骨不全家系的致病原因，本研究结果丰富了COL1A1、COL1A2基因突变谱，为家系的遗传咨询和产前诊断提供了依据。

成骨不全症家系C0L1A1／2基因的大片段缺失突变分析

目的在成骨不全症（osteogenesisimperfecta，OI）家系中进行COLlAl／e基因内大片段缺失突变的鉴定。方法应用多重连接探针扩增（multiplexligation-dependentprobeamplification，MLPA）方法对46例PCR-测序未见COLIAl／e基因突变的0I患者进行COL1A1／2基因大片段缺失突变检测，进一步应用荧光定量PCR或Gap—PCR-测序法对MLPA方法检测到的缺失突变进行验证。结果通过MLPA分析，在46例0I患者中检测到2例杂合性大片段缺失突变，先证者A为整个COL1A1基因的杂合缺失，先证者B为COL1A2基因第20外显子的杂合缺失；荧光定量PCR结果证实先证者A携带整个COLIAl基因的杂合缺失突变；Gap—PCR、DNA测序和凝胶电泳分析结果证实先证者B存在COLl4e基因内第17～23外显子的杂合缺失，断裂点区域有一个来自于5号染色体、长度637bp的DNA插入片段；先证者B家系成员突变验证显示其母亲为同一突变的杂合子。结论在中国人0I患者中发现了COL1A1和COL1A2基因的大片段缺失突变。本研究结果丰富了中国人群I型胶原相关OI致病基因突变谱，也为患病家系的产前基因诊断奠定了基础。