基于COMSTAT软件对微生物被膜进行定量分析的方法与意义

目的:微生物被膜是一种具有协调性、功能性和高度结构性的膜状复合物,它可以为微生物提供良好的生存环境,免受外界因素的干扰。研究发现,具有产生微生物被膜能力的细菌治病性明显增强,而现今缺乏一种分析微生物被膜的有效手段。本文探讨利用COMSTAT软件对微生物被膜进行定量分析的方法和意义,为对微生物被膜定性定量分析提供支持手段,从而为研究微生物被膜致病性提供方法理论基础。方法:以葡萄球菌为研究模型,利用激光扫描共聚焦显微镜成像技术,结合COMSTAT微生物被膜分析软件对微生物被膜的单位面积生物量、基质覆盖率、平均厚度、粗糙系数等方面进行定量分析,研究了该葡萄球菌的生物被膜生长变化过程,并考察了抗生素对其生物被膜的抑制作用。结果:在葡萄球菌生物被膜生长过程中,生物量、平均厚度以及平均扩散距离等结构指标数值都有明显增加,而粗糙度和表面积与生物量比值呈现降低趋势,表明了微生物被膜由发生向成熟的转化过程。与此同时,经10μg/mL和100μg/mL的卡那霉素处理得到的葡萄球菌微生物被膜生长受到明显抑制,且随着卡那霉素的浓度增加,抑制效果随之增加。结论:本文运用COMSTAT软件的分析方法首次从生物量、平均厚度等结构指标数值的角度描述了葡萄球菌生物被膜,从而有效评价微生物被膜发生、发展、成熟以及崩解的生长过程。该技术在研究微生物被膜形成的理论机制方面存在潜在价值,可以为研究微生物被膜治病性提供理论基础,具有理论指导意义。

不同培养基质上阪崎克罗诺杆菌生物膜的比较

为了比较阪崎克罗诺杆菌在玻璃、聚丙烯及不锈钢表面形成的生物膜,将培养48 h的阪崎克罗诺杆菌生物膜经荧光染料SYTO 9/PI标记后,用激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope,CLSM)联合COMSTAT软件定性定量地分析生物膜结构。结果表明:阪崎克罗诺杆菌在3种材料表面形成的生物膜的总生物量、平均厚度及平均扩散距离依次是不锈钢>聚丙烯>玻璃,粗糙系数及表面积与生物量比值则为不锈钢<聚丙烯<玻璃,生物膜的菌体活死比例是玻璃高于聚丙烯、不锈钢。另外,标准菌株ATCC 29544生物膜的总生物量、菌体活死比例、平均厚度及平均扩散距离均高于分离株Ⅰ、Ⅱ,粗糙系数及表面积与生物量比值均低于分离株。可见,阪崎克罗诺杆菌在不锈钢表面的成膜性强于玻璃与聚丙烯,标准菌株ATCC 29544的成膜能力高于2株食品分离菌株。

阪崎克罗诺杆菌生物膜结构的定量分析

为了建立阪崎克罗诺杆菌的孔板置片成膜模型,将不同培养时间（6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h和72 h）的生物膜经荧光染料标记后,运用激光共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）联合COMSTAT定量分析生物膜形成过程的结构变化,同时用结晶紫（crystal violet,CV）染色法分析生物量。结果显示：随着培养时间延长,A570先升后降,在60 h有最大值;总生物量、平均厚度及平均扩散距离也先升后降,在60 h有最高值,活死比例、粗糙系数及表面积与生物量比值先降后升,最低值分别在60 h、48 h与60 h;胞外多糖先增后减。阪崎克罗诺杆菌生物膜形成包括：粘附阶段（0~12 h）、发展阶段（12~48 h）、成熟阶段（48~60 h）及解聚再定植阶段（〉60 h）。CLSM-COMSTAT法在定性观察生物膜结构的同时,还可定量分析结构参数,且该法得到的总生物量变化趋势与CV染色法一致,说明CLSMCOMSTAT法可作为分析阪崎克罗诺杆菌生物膜的常规方法。

烟曲霉生物被膜体外flow chamber模型成膜能力研究

目的比较烟曲霉生物被膜(BF)在体外流动与静止模型中的成膜能力,获取较佳的体外研究模型,为烟曲霉今后的体外研究提供技术方法支持。方法分别建立烟曲霉生物被膜体外流动模型和静止模型,在生物被膜形成的不同阶段行FITC-Canavalia ensiformis(FITC-ConA)胞外基质(ECM)染色,激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)观察烟曲霉生物被膜三维(3D)形态,COMSTAT软件定量分析3D图像堆,比较两种培养状态下生物被膜的生物量、平均厚度等生长指标。结果在静止模型和流动模型中,BF的生物量、平均厚度、基质覆盖率、平均扩散距离均随着培养时间的延长而升高,粗糙系数、表面积与生物量比随着培养时间的延长而降低;相同时间点下,静止模型组形成的BF的生物量、平均厚度、基质覆盖率、平均扩散距离较流动模型组的高,差异有统计学意义(P<0.05);静止模型组粗糙系数和表面积与生物量比较流动模型组的低,前者差异有统计学意义(P<0.05),后者差异无统计学意义。结论烟曲霉在流动模型中亦可形成稳定的生物被膜,但静止模型可分泌更多的ECM,形成更厚的生物被膜,更利于研究者对体外烟曲霉BF进行研究。