COP9信号复合体亚基在肿瘤中的作用研究进展

COP9信号复合体(CSN)是一种存在于动植物中的高度保守的多蛋白复合物,由8个亚基(CSN1/COPS1~CSN8/COPS8)组成。CSN可通过Cullin的去甲酰泛素化调节Cullin-RING E3-连接酶活性,进而通过泛素-蛋白酶体系统控制蛋白质降解。CSN亚基在细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、肿瘤的发生、细胞周期的调节、DNA的损伤修复等过程中发挥重要作用,某些亚基还有望作为肿瘤治疗的靶点。因此,未来深入研究CSN亚基在恶性肿瘤中的作用,可为恶性肿瘤的治疗提供新思路。

黄瓜COP9信号复合体亚基CsCSN5b的亚细胞定位和表达分析

COP9信号复合体(Constitutively photomorphogennic signalosome,CSN)是一种在黑暗条件下抑制光形态建成的调节蛋白[1],1992年在研究调控拟南芥的光形态建成的转录因子时被发现,突变体拟南芥在黑暗条件下,子叶展开,下胚轴缩短,这一表型与野生型拟南芥在光照下幼苗生长的形态一致。

真菌中COP9信号复合体的研究进展

泛素连接酶(CRLs)主要通过泛素蛋白酶体途径来调控信号转导、转录、细胞增殖、生理节律、细胞发育等多种生化过程。COP9信号复合体(CSN)是真核细胞内高度保守的多亚基蛋白复合物,其主要功能是调控泛素相关的蛋白降解。高等真核生物缺失任何一个CSN亚基都会使突变株在发育早期致死,但真菌的CSN亚基缺失突变株能够存活,因此真菌成为研究CSN的系统进化、结构组成及生物学功能的理想材料。着重介绍了真菌中CSN的亚基组成、生物学功能及研究展望,为真菌及其他真核生物中CSN的功能研究提供一定的参考数据。

COP9信号复合体在真菌生长发育及次级代谢过程中的作用研究进展

COP9信号复合体(CSN)是真核生物中高度保守的蛋白复合物,参与调控整个生命过程,目前的研究主要集中在人类和动植物中,而关于真菌COP9信号复合体的研究主要集中在几个模式真菌,其他真菌相关研究较少,国内对真菌COP9信号复合体的研究更少。从真菌COP9信号复合体的组成和结构特征、调控真菌生长发育的机制以及协调次级代谢等方面进行综述,并对其现存的疑惑进行了分析,以期为进一步研究COP9信号复合体在真菌中的作用提供参考。

COP9信号复合体:信号转导与蛋白质降解的接合器

COP9信号复合体 (CSN)是细胞内高度保守的多亚基蛋白质复合物 ,主要定位于真核细胞的细胞核。在结构上与 2 6S蛋白酶体“盖子”亚复合物高度相关。CSN的具体功能目前尚未明确 ,主要体现为两方面的活性 :脱Nedd化作用和磷酸化作用 ;在细胞内同SCF遍在蛋白连接酶复合体等许多蛋白质复合物发生相互作用 ;调节多种信号分子靶向遍在蛋白 2 6S蛋白酶体的稳定性。因此 ,CSN是连接信号转导与蛋白质降解的分子平台。

新生隐球菌COP9复合体基因CSN6的敲除与鉴定

目的构建新生隐球菌COP9复合体蛋白元件Csn6的基因同源重组敲除框,并通过基因枪转化系统敲除CSN6基因。方法应用生物信息学方法获得COP9复合体蛋白元件的基因信息,采用套叠PCR的方法,构建包含报告基因NEO和CSN6基因ORF两侧上下游同源DNA片段的同源重组框。应用基因枪将其转化入新生隐球菌感受态细胞,通过PCR和DNA测序对遗传霉素(G418)耐受的阳性克隆子进行筛选与验证。结果成功构建了新生隐球菌基因突变株csn6裣。结论 COP9复合体亚基CSN6基因突变株的构建,为今后新生隐球菌COP9复合体的分子致病机制研究奠定基础。

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体(CSN)是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1～HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。

家族性高血钾型高血压Cullin3致病突变体neddylation异常的分子机制研究

目的·探讨Cullin3(CUL3)致病突变体Cullin3Δ9(缺失9号外显子,CUL3Δ9)是否由于与COP9信号体(CSN)结合减弱而导致其类泛素化修饰异常。方法·使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养HEK293细胞株,采用脂质体转染技术,将CSN5 siRNA与FLAG-CUL3质粒或FLAG-CUL3Δ9质粒共转染HEK293细胞,Western blotting观察CUL3和CUL3Δ9类泛素化修饰程度的变化;转染FLAG-CUL3或FLAG-CUL3Δ9质粒后,以金属蛋白酶抑制剂1,10-菲咯啉进行预孵育,Western blotting观察CUL3和CUL3Δ9类泛素化修饰程度的变化;在转染FLAG-CUL3质粒和FLAG-CUL3Δ9质粒后,以FLAG抗体与Dynabeads Protein G磁珠行免疫共沉淀,Western blotting观察CUL3或CUL3Δ9与CSN5的结合状态。结果·转染CSN5 siRNA后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3Δ9的类泛素化修饰程度无明显变化;以1,10-菲罗啉预孵育后,CUL3的类泛素化修饰程度增加,而CUL3Δ9的类泛素化修饰程度无明显变化;免疫共沉淀结果显示CUL3与CSN5结合,而CUL3Δ9与CSN5结合减弱。结论·CUL3Δ9与CSN结合减弱导致类泛素化修饰异常。

Ku86通过调控TOP1和COPS5影响上皮性卵巢癌细胞对于顺铂的化疗敏感性

背景与目的:卵巢癌是妇科恶性肿瘤中发病率排名第3、致死率排名第1的疾病。卵巢癌的预后很差,这是由于大部分患者确诊时已处于晚期并且对铂类药物化疗易耐药,异常的DNA修复是导致铂类耐药的重要原因,针对性地干扰DNA损伤修复相关分子可能是提高铂类药物化疗敏感性的新手段。Ku86是参与非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)过程的一个关键分子,能够有效地修复DNA双链断裂(DNA double-strand break,DSB)。方法:使用免疫组织化学染色和细胞免疫荧光法检测Ku86在卵巢癌组织和细胞中的定位。使用RNAi技术下调Ku86,用顺铂处理后使用流式细胞术检测凋亡,使用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)法检测IC_(50)。使用蛋白质印迹法(Western blot)分别检测并分析Ku86与拓扑异构酶Ⅰ(topoisomeraseⅠ,TOP1)及COP9信号复合体的第5种成分(the fifth component of the COP9 signalosome,COPS5)的关系。结果:下调Ku86可以减少由于顺铂引起的细胞凋亡,降低卵巢癌细胞对于顺铂的敏感性。Ku86对顺铂在卵巢癌药物敏感性中的这种影响可能是通过调节TOP1和COPS5发挥作用的。结论:TOP1和COPS5都是与DNA损伤修复有关并能影响铂类药物化疗敏感性的重要分子,下调Ku86会使TOP1的表达增高和COPS5的表达减少。卵巢癌中与铂类药物敏感性有关的生物标志物之间有相关性,靶向Ku86的治疗可能是提高卵巢癌药物敏感性的有效策略。

甲状腺激素受体相关蛋白15的研究进展

甲状腺激素受体相关蛋白15(TRIP15)是一个核受体家族的选择性转录共抑制子,参与构成COP9信号复合体,调节机体蛋白质的降解。TRIP15与涉及转录调节、细胞周期调控、DNA损伤修复的多种生物大分子相互作用,参与细胞增殖、分化、凋亡等重要生理过程,其表达调控的信号通路与肿瘤、脂质代谢紊乱及内分泌疾病的发生与发展密切相关。TRIP15具有复杂的蛋白质相互作用网络及多样的生物学功能,可能会成为疾病治疗的新靶点。

JAB1研究进展

JAB1可通过与AP 1特异位点的结合形成稳定复合物 ,促进靶基因的反式激活。JAB1可与三大类蛋白质相互作用 :①COP9信号体亚单位 :COP9信号体 1、COP9信号体 2、COP9信号体 4、COP9信号体 7。②细胞周期调节蛋白 :p2 7Kip1、MIF。③AP 1转录调节蛋白 :c Jun ,LFA 1,LHR ,PR ,SRC 1,Bcl 3,p5 3,HPO ,HIF。JAB1参与许多信号转导通路 ,包括调节植物的光信号、线虫的幼虫发育、整合素信号、细胞周期调控和甾体类激素的信号转导。

C-Jun结合蛋白的研究进展

C-Jun蛋白N-端激活区结合蛋白-1(c-jun-activation-domain binding protein-1,JAB1),即C-Jun结合蛋白.JAB1通过与四大类蛋白质的相互作用,调控其活性及稳定性.4大类蛋白质包括:(1)细胞周期调节蛋白:p27kip1、MIF等;(2)COP9信号体亚单位:S1、S2、S3、S4;(3)AP-1转录调节蛋白:C-Jun、rLHR、LFA-1、P53等;⑷调节神经蛋白:IRE1α、HAND2等.

家蚕JAB1/CSN5蛋白的基因克隆表达及亚细胞定位

JAB1/CSN5是COP9信号复合体(constitutive photomorphogenic signalosome CSN)的第5个亚基,内嵌的JAMM基序是CSN参与蛋白的泛素化降解途径并调控生物体生长发育过程的异构酶活性位点。在家蚕蛹cDNA文库中筛选到的一条基因序列,其ORF长度为1047 bp,预测编码蛋白含有JAB1/CSN5保守结构域JAB-MPN,因此命名为BmJM。将BmJM基因的ORF插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmJM,于E.coliRosetta菌中进行原核表达,重组蛋白以包涵体形式存在。以纯化后的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得BmJM的多克隆抗体,采用RT-PCR、Western blotting方法对BmJM基因在家蚕不同发育时期和组织中的转录及蛋白表达水平进行分析,发现BmJM蛋白在家蚕5龄幼虫的生殖腺表达量最高,而在其他组织中表达量较少,由此初步揭示了JAB1/CSN5在家蚕生长发育过程中的作用。亚细胞定位测定表明BmJM蛋白在细胞质近核区域含量最高,在细胞核中也有分布。

烟草CSN4基因的原核表达及纯化

以野生型烟草(Nicotiana tabacum)为试验材料,采用RT-PCR克隆获得CSN复合体亚基CSN4c DNA序列,基因登录号为KC866360。序列分析表明,CSN4基因ORF长为1194 bp,编码398个氨基酸,蛋白分子质量为43.78 k Da。将CSN4构建至原核表达载体,获得重组子pET28a-CSN4/BL21(DE3),通过Ni-IDA亲和层析纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western Blotting检测,结果显示:0.25 mM IPTG,15℃诱导16 h获得浓度为0.476 mg/m L、纯度高达95%的CSN蛋白,为后续CSN4基因功能研究奠定了基础。

促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2相互作用的细胞死亡中介物在诱导肝细胞凋亡中的作用

目的 探讨促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）相互作用的细胞死亡中介物（Bim）在诱导肝细胞凋亡中的作用及其机制.方法 采用基因敲除技术在小鼠肝细胞内特异性去除COP9信号体亚基8（Csn8）基因诱导肝细胞凋亡,通过Western blot测定Cullin-Ring E3连接酶复合物中Cullin2和细胞因子诱导的含SH2蛋白（CIS）的改变,各种凋亡相关分子的蛋白表达以及肝细胞原位缺口末端标记法（TUNEL）荧光染色变化.结果 在肝内敲除Csn8基因可激活半胱氨酸蛋白酶-9（1.109±0.152比1.762±0.434,P＜0.01）和半胱氨酸蛋白酶-3（1.216 ±0.244比3.680±0.445,P＜0.01）,免疫荧光染色提示Csn8缺失组肝细胞内TUNEL染色阳性的细胞核数明显增加[（1.6±0.9）％比（22.8±2.1）％,P＜0.01].同时,Csn8基因敲除可引起E3连接酶CIS表达降低（2.103±0.365比1.089±0.423,P＜0.01）,Cullin2的Neddylated蛋白表达增加（1.133±0.149比1.926±0.139,P＜0.01）;此外,Csn8缺失明显上调促凋亡蛋白Bim的蛋白表达（1.058±0.067比2.283±0.263,P＜0.01）,伴有B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）家族成员bcl-2、bcl-xL和B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白（bax）的蛋白表达增加.免疫共沉淀实验提示,促凋亡蛋白Bim能与抗凋亡蛋白bcl-2结合,而不是与bcl-xl或bax间相互作用,从而诱导肝细胞凋亡的发生.结论 在Csn8基因敲除所诱导的肝细胞凋亡中,E3连接酶CIS的功能失活可引起促凋亡蛋白Bim的表达增加;而Bim通过与抗凋亡的bcl-2蛋白结合并拮抗它的作用,从而间接地活化bax启动肝细胞凋亡.

CSN6对人乳腺癌细胞增殖的影响

目的观察COP9信号复合体(COP9 signalosome,CSN)6号亚单位(CSN6)对乳腺癌细胞(MCF-7)增殖的影响。方法应用Western blot检测CSN6和PTEN蛋白表达,MTT法及划痕损伤实验检测转染CSN6及磷酸酶基因(PTEN)质粒的细胞增殖生长的情况。结果 MCF-7细胞转染shRNA-CSN6,在CSN6蛋白表达降低的同时,PTEN的表达增高。乳腺癌细胞MDA-MB-468细胞在转染PTEN后,其增殖受到抑制,而转染CSN6后,能够逆转PTEN的抑制作用,促进细胞生长。结论 CSN6有可能通过降解PTEN而引起乳腺癌细胞的增殖生长。