新生隐球菌COP9复合体基因CSN6的敲除与鉴定

目的构建新生隐球菌COP9复合体蛋白元件Csn6的基因同源重组敲除框,并通过基因枪转化系统敲除CSN6基因。方法应用生物信息学方法获得COP9复合体蛋白元件的基因信息,采用套叠PCR的方法,构建包含报告基因NEO和CSN6基因ORF两侧上下游同源DNA片段的同源重组框。应用基因枪将其转化入新生隐球菌感受态细胞,通过PCR和DNA测序对遗传霉素(G418)耐受的阳性克隆子进行筛选与验证。结果成功构建了新生隐球菌基因突变株csn6裣。结论 COP9复合体亚基CSN6基因突变株的构建,为今后新生隐球菌COP9复合体的分子致病机制研究奠定基础。

植物COP9信号复合体的结构特征和功能

文章介绍植物COP9信号复合体(CSN)的结构特征及其与19S"盖子"结构相互关系,以及CSN参与的NEDD化/去NEDD化的过程研究进展。

家蚕JAB1/CSN5蛋白的基因克隆表达及亚细胞定位

JAB1/CSN5是COP9信号复合体(constitutive photomorphogenic signalosome CSN)的第5个亚基,内嵌的JAMM基序是CSN参与蛋白的泛素化降解途径并调控生物体生长发育过程的异构酶活性位点。在家蚕蛹cDNA文库中筛选到的一条基因序列,其ORF长度为1047 bp,预测编码蛋白含有JAB1/CSN5保守结构域JAB-MPN,因此命名为BmJM。将BmJM基因的ORF插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmJM,于E.coliRosetta菌中进行原核表达,重组蛋白以包涵体形式存在。以纯化后的重组蛋白为抗原免疫大白兔获得BmJM的多克隆抗体,采用RT-PCR、Western blotting方法对BmJM基因在家蚕不同发育时期和组织中的转录及蛋白表达水平进行分析,发现BmJM蛋白在家蚕5龄幼虫的生殖腺表达量最高,而在其他组织中表达量较少,由此初步揭示了JAB1/CSN5在家蚕生长发育过程中的作用。亚细胞定位测定表明BmJM蛋白在细胞质近核区域含量最高,在细胞核中也有分布。

COP9信号小体亚基CsnE对无花果拟盘多毛孢生长发育和次级代谢的影响

COP9信号小体,又称CSN,是一个多亚基蛋白复合物,在所有真核生物体中高度保守,调控着多个重要的生物学过程.研究证明,CSN复合体的第5个亚基CsnE调控丝状真菌的生长发育和次级代谢.本研究以植物内生真菌无花果拟盘多毛孢(Pestalotiopsis fici)为研究对象,揭示了CsnE对孢子形成及次级代谢的调控作用.根据构巢曲霉中CsnE蛋白的氨基酸序列,利用BLAST进行比对,在无花果拟盘多毛孢基因组中找到与其同源的序列PfCsnE.PfcsnE基因的缺失突变株(△PfcsnE)不再产生孢子,而回补PfcsnE基因,孢子恢复产生,这表明PfCsnE对P.fici孢子的形成是必不可少的.对次级代谢产物进行分析发现,与野生型菌株(WT)相比,ΔPfcsnE菌株chloroisosulochrin产量增加,而ficiolideA产量减少.对WT和ΔpfcsnE菌株进行转录组分析发现,PfCsnE影响了8.37%的基因的表达.其中,在ΔPfcsnE菌株中涉及孢子形成的多个基因表达量下降,此外,9个次级代谢生物合成基因簇表达量上升,3个下降.综上所述,PfCsnE对P.fici孢子形成及次级代谢起到非常重要的调控作用.