COPS3基因cDNA的克隆及表达

目的:克隆COPS3基因cDNA,构建其原核融合蛋白表达载体并表达和鉴定。方法:从培养的人骨肉瘤细胞系SOSP-9607细胞中提取总RNA,经RT-PCR获得COPS3基因。将该基因克隆到pGEM-T-Easy载体中,酶切及测序鉴定。将COPS3基因插入pET28 a融合蛋白表达载体中,IPTG诱导表达,进行SDS-PAGE分析。免疫印迹法鉴定COPS3蛋白的表达。结果:cDNA测序证明,获得了COPS3基因cDNA,其序列与Genebank中报道序列完全一致。酶切分析表明,成功构建了含COPS3基因的pET28 a融合蛋白表达载体。SDS-PAGE以及免疫印迹法鉴定分析表明,COPS3蛋白获得高效表达,分子质量为51Ku,表达量约占菌体总蛋白的30%。结论:成功克隆和表达了COPS3 cDNA。

shRNA干扰COPS3基因对人成骨肉瘤细胞的影响

目的:探究shRNA干扰COPS3基因对人成骨肉瘤细胞基因水平、蛋白水平、增殖能力等方面的影响。方法:选择人成骨肉瘤Saos-2细胞,感染pLKO.1-COPS3shRNA病毒质粒作为Saos-2siCOPS3细胞(实验组),感染pLKO.1-TRC control病毒质粒作为Saos-2CON细胞(对照组),感染成功后进行细胞培养,收集细胞用RT-PCR测定COPS3基因mRNA表达量,Western blot检测蛋白表达水平,MMT测定细胞增殖能力,对裸鼠接种细胞悬液进行裸鼠成瘤试验。结果:Saos-2siCOPS3细胞中,COPS3基因mRNA表达水平与对照组相比下降(P<0.05),蛋白表达水平、细胞增殖能力与对照组相比下降(P<0.05),干扰COPS3基因与对照组相比抑制肿瘤体积、重量增加(P<0.05)。结论:COPS3调控骨肉瘤细胞的增殖与骨肉瘤的发生、发展密切相关。

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段,克隆入pUC19质粒,经测序正确后,插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中,将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果成功获得COPS3基因片段,其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性,对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。

COPS3的稳定干涉细胞系建立及其在NLRP3炎症小体激活中的作用

COPS3(COP9 signalosome subunit 3)作为COP9信号复合体的第三个亚基,在多种恶性肿瘤中高表达。本实验室通过酵母双杂交系统筛选,发现COPS3与NLRP3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3)存在相互作用。目前关于COPS3与NLRP3炎症小体的相关性未见文献报道。为了研究COPS3对NLRP3炎症小体的影响,利用慢病毒感染系统建立了稳定干涉COPS3的THP1细胞系。首先将COPS3的不同干涉序列片段稳定整合到THP1细胞中,通过嘌呤霉素压力筛选,应用实时定量荧光PCR(real time PCR)手段检测COPS3的干涉效果,最终确定成功建立干涉COPS3的稳定细胞株。在稳定敲低COPS3的细胞株中,发现NLRP3炎症小体的激活受到明显抑制。综上提示,COPS3能够正向调节NLRP3炎症小体的激活。

RNA干扰COPS3表达对肺癌细胞增殖影响的分析

目的本研究应用RNA干扰(RNA interference,RNAi)方法抑制COPS3基因表达,分析其对肺癌细胞增殖的影响并探讨其相关机制,以期初步阐明COPS3基因在肺癌发展中的作用。方法以肺癌细胞株A549为研究对象,分别将携带有COPS3基因siRNA(Small interfering RNA)序列的慢病毒载体(si-COPS3)和携有无关序列的对照载体感染A549细胞株,应用实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和western blot方法分析COPS3mRNA及蛋白表达水平;BrdU法分析细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化与细胞凋亡情况。结果成功构建了COPS3慢病毒RNAi载体,并成功感染A549细胞;与对照组相比,感染有si-COPS3的细胞COPS3mRNA及蛋白表达水平均显著下降,细胞增殖受抑制,细胞凋亡增加;大部分细胞周期滞于G0/G1期。结论下调COPS3基因水平可以抑制肺癌细胞增殖并促进其凋亡。COPS3慢病毒RNAi的建立为进一步研究COPS3的功能奠定了基础。

RNA干扰COPS3基因抑制骨肉瘤细胞HOS增殖和迁移能力的实验研究

目的探讨COPS3基因的表达对骨肉瘤细胞系HOS增殖和迁移能力的影响。方法构建针对COPS3 mRNA的慢病毒表达载体(Lenti-COPS3si)和阴性对照载体(Lenti-NC),并将其感染高表达COPS3基因的人骨肉瘤细胞系HOS。实时定量PCR检测COPS3 mRNA的表达;Western blot测定COPS3的蛋白表达;噻唑蓝(MTT)比色法检测HOS细胞的增殖能力;迁移实验检测HOS细胞迁移能力的改变。结果与空白对照组和转染LentiNC的阴性对照组相比,转染48h后Lenti-COPS3si组COPS3 mRNA和蛋白的表达均明显降低,转染48h后,LentiCOPS3si组HOS细胞的增殖能力明显下降(P<0.05)。迁移实验结果显示,与空白对照组和阴性对照组相比,细胞的迁移能力下降(P<0.05)。结论慢病毒载体Lenti-COPS3si可以特异性抑制骨肉瘤细胞系HOS中COPS3的表达,并显著降低细胞的增殖和迁移能力,此技术有望成为抑制骨肉瘤生长和转移的新途径。

COPS3在肝癌中的表达

目的研究构成型光形态建成同源亚基3(COPS3)在肝癌中的表达。方法应用免疫组织化学SP法及RT-PCR法检测肝癌组织中COPS3表达情况。结果肝癌组织中COPS3蛋白表达阳性率〔46.7%(14/30)〕明显高于正常肝脏组织〔23.3%(7/30),χ2=5.654,P=0.017〕及肝硬变组织〔36.7%(11/30),χ2=4.979,P=0.026〕,差异具有统计学意义。肝癌组织中COPS3 m RNA的转录水平亦明显高于肝硬变及正常肝脏组织,差异具有统计学意义(P<0.05);在肝癌组织中,COPS3在细胞核中的表达阳性率明显高于在细胞浆中的表达阳性率(χ2=6.674,P=0.009)。结论 COPS3在肝癌组织中表达水平和定位均发生改变,可能参与了肝癌的发生和发展过程。

团簇Ni_3CoP电子性质与磁性研究

设计团簇Ni_3CoP模型对非晶态合金Ni-Co-P进行局域结构的模拟,基于密度泛函理论(DFT)并在B3LYP/Lanl2dz水平下运用Gaussian 09程序对其进行结构优化以及有关电子性质与磁性的计算,对所得到的理论数据进行分析.结果表明:团簇Ni_3CoP费米能级左侧的最高峰由Ni-d、Co-d、P-p共振产生,形成了d-d-p杂化的成键轨道,并主要由Ni-d轨道贡献;对于团簇Ni_3CoP内部的电子转移,以P原子提供电子的能力最强,Co原子次之,Ni原子则整体以接受电子为主.团簇Ni_3CoP 3重态下的构型具有磁性,且Ni原子磁矩对团簇总磁矩的贡献较大.分析d轨道的电子自旋态密度图,发现其对称性最不好,这说明其上的成单电子最多,是团簇磁性的主要来源.同时,研究还发现p轨道对团簇磁性的贡献同样不可忽略.

团簇Ni_3CoP催化析氢活性研究

基于密度泛函理论(density functional theory,DFT),在B3LYP/lanl2dz水平下对团簇Ni3CoP的初始构型进行单、三重态下的计算得到优化构型,依据前线轨道理论(frontier molecular orbital theory,FMO)着重通过分析前线轨道图以及比较前线轨道能级差对团簇Ni3CoP催化水析出氢气时的反应机理进行理论研究,结果表明:团簇Ni3CoP通过其最高占据分子轨道(highest occupied molecular orbital,HOMO)与水分子最低未占分子轨道(lowest unoccupied molecular orbital,HUMO)间的电子流动完成氢原子的吸附,且三重态构型在与水分子作用时,其β-HOMO轨道在反应中起主导作用。三重态构型在吸附氢原子后其促进解吸过程析出氢气的催化活性显著下降,而唯一的单重态构型1(1)不仅能在与水分子反应吸附氢原子的过程中展现出较好的催化效果,其在解吸过程中更是表现出了远好于其他三重态构型的催化能力。

团簇Ni_3CoP的成键和催化性质

基于密度泛函理论,以团簇Ni_3CoP为模型对非晶态合金Ni-Co-P的成键性质以及催化活性进行研究。发现团簇Ni_3CoP各构型中不同原子间的成键强度与作用效果存在差异,且对团簇Ni_3CoP的稳定性产生较大影响,其中Co-P成键键级所占比例的大小是单重态与三重态构型稳定性出现较大差异的主要原因;团簇Ni_3CoP中各原子对前线HOMO、LUMO轨道均有不同程度的贡献,为团簇Ni_3CoP的催化反应提供了良好的催化环境;Ni原子是前线轨道的主要贡献者且贡献分布范围广,说明Ni原子最有可能作为团簇Ni_3CoP潜在的催化准活性位并且能使团簇Ni_3CoP呈现出多样的催化活性;此外,Ni原子与Co原子对前线轨道的贡献呈"此消彼长"之势。

团簇Ni_3CoP的结构和热力学稳定性

为深入了解非晶态合金Ni-Co-P的性质,以团簇Ni_3CoP为模型,基于密度泛函理论对其进行多方面的分析,包括稳定存在的构型、各构型所占比例、各种能量参数等以探究其稳定性,发现团簇Ni_3CoP除构型5(1)为戴帽三角锥型外,其余所有稳定存在的构型均为三角双锥型。单重态各构型和三重态各构型所占比例变化及各种能量参数的变化均比较平缓,但在单重态构型1(1)与三重态构型4(3)之间出现剧变点,团簇Ni_3CoP能稳定存在的临界能量约为-659.450 a.u。从能量学的角度看,多重度的改变对团簇Ni_3CoP构型的稳定性有较大影响,三重态构型的稳定性均好于单重态构型,构型1(3)所占比例最高,能量最低,结合能最大,吉布斯自由能变最小,是团簇Ni_3CoP最有可能稳定存在的形式。

团簇Ni_3CoP催化性质的前线轨道研究

以团簇Ni_3CoP为模型,从前线轨道的角度对非晶态合金Ni-Co-P的催化性质进行研究。发现团簇Ni_3CoP各构型中不同原子对其前线轨道均有不同程度的贡献,且Ni原子的贡献最大,说明Ni原子最有可能作为团簇Ni_3CoP潜在的催化准活性位点;分析各构型的能隙差,发现团簇Ni_3CoP中唯一的戴帽三角锥型5(1)的能隙差最小,在化学反应中可能具有较强的反应活性;分析团簇Ni_3CoP各构型的态密度图,发现团簇Ni_3CoP作为催化剂在催化反应过程中具有较强的提供电子的能力,但同时其接受电子的能力也不能忽视,说明团簇Ni_3CoP是十分优良的催化剂。

团簇Ni_3CoP异构化反应

采用密度泛函理论方法,在B3LYP/lanl2dz水平下对团簇Ni3Co P进行量子化学计算,得到其优化构型。以过渡态理论为基础,对团簇Ni3Co P优化构型间的异构化反应进行化学动力学与化学热力学两方面的研究以探究团簇Ni3Co P最终可稳定存在的形式。结果表明:团簇Ni3Co P不同重态间的构型不存在转化;热力学稳定性较好的三重态构型异构化的趋势小,可单独稳定存在的可能性大,仅存在构型4(3)与3(3)间的可逆转化;单重态构型的异构化反应以构型4(1)为起点,可直接或间接(以构型2(1)、3(1)为中间体)地向构型1(1)进行转化且反应的限度较大,说明构型1(1)是团簇Ni3Co P单重态构型的主要存在形式。

关于日本新能源政策的推进

环境调和型社会的形成和必要性的说法已经很久了，但1997年12月在京都召开的COP3(关于气候变化的联合国框架条约第三次协约国会议)以来，这个潮流已经正规化。因此，以原来的经济成长、能源稳定供给和环境调和为目标所进行的日本能源政策对环境问题相应的重要性也增加了一层。

光信号转导通路研究进展

光是植物生长发育的能量来源,因此植物需要时刻感受周围的光环境并做出恰当的反应,以使自身获得最 大的生存优势。在长期的自然选择过程中,植物进化出了复杂的光信号转导通路来感知各种光照条件。本研究将 通过介绍光受体、E3泛素连接酶 COP1和转录因子 HY5组成的信号转导通路来阐明植物感受光的分子机制。