CORM-3通过调控巨噬细胞极化促进MC3T3-E1细胞成骨分化的研究

目的:研究一氧化碳释放分子-3(carbon monoxide releasing molecule-3,CORM-3)对巨噬细胞极化的调控作用,进一步探究CORM-3介导的巨噬细胞免疫环境对MC3T3-E1细胞增殖和成骨分化的影响。方法:体外培养RAW264.7细胞,筛选可用的CORM-3浓度。RT-qPCR检测iNOS、TGF-β、IL-10等M1/M2相关基因的表达。免疫荧光染色检测各组血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白的表达。流式细胞术检测24 h后各组M1/M2巨噬细胞的比例。收集24 h后的上清液制备条件培养基,应用CCK-8、碱性磷酸酶染色和茜素红染色及RT-qPCR等检测MC3T3-E1细胞的增殖和成骨活性。结果:RT-qPCR结果显示CORM-3促进了TGF-β和IL-10的表达,降低了iNOS的表达(P<0.05),免疫荧光实验结果显示CORM-3增加RAW264.7细胞HO-1的蛋白表达,在CORM-3调控巨噬细胞的环境下,RT-qPCR结果显示CORM-3提高了OCN、Runx2及Col-1等基因的表达(P<0.05),MC3T3-E1的增殖和成骨分化增强。结论:CORM-3可通过释放CO提高HO-1的蛋白水平,促进巨噬细胞RAW264.7细胞向M2表型极化,增强MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。

CORM-3在减轻失血性休克复苏大鼠认知功能障碍及皮质神经细胞焦亡中的作用

目的探讨CORM-3在减轻失血性休克复苏大鼠认知功能障碍及皮质神经细胞焦亡中的作用。方法168只清洁级健康雄性SD大鼠按随机数字表法分为4组:假手术组、失血性休克复苏组、CORM-3组和iCORM-3组,每组42只。后3组大鼠建立失血性休克复苏模型,CORM-3组在复苏结束后立即向股静脉注射CORM-3(4mg/kg),iCORM-3组立即向股静脉注射iCORM-3(4mg/kg)。假手术组和失血性休克复苏组只注射含DMSO的等量生理盐水。失血性休克复苏模型的制备方法为:通过股动脉放血将平均动脉压降至25~35mmHg并维持60min,随后将收集的血液在15min内回输体内达到初始血压水平作为复苏,必要时输注生理盐水。于复苏结束后12h处死大鼠取皮质,采用气相分析法测定皮质区一氧化碳(CO)含量,Western blotting法检测皮质区细胞核内核转录相关因子2(Nrf2)、BTB-CNC异体同源体1(Bach1)及细胞质内血红素氧合酶-1(HO-1)、白介素(IL)-1β和IL-18的表达,通过免疫荧光染色法测定活化caspase-1-Cy3/神经元特异性核蛋白(NeuN)-FITC/DAPI阳性细胞数,计算皮质神经元焦亡率。最后于复苏后30d行旷场实验评价大鼠认知功能。结果与假手术组比较,失血性休克复苏组、CORM-3组和iCORM-3组在复苏后12h时皮质区CO含量增加,皮质神经元焦亡率升高,Nrf2/Bach1比率上调,HO-1、IL-1β和IL-18表达上调,跨格次数和直立次数减少,中央停留时间延长,差异均有统计学意义(P<0.05)。与失血性休克复苏组和iCORM-3组比较,CORM-3组在复苏后12h时皮质区CO含量增加,皮质神经元焦亡率降低,Nrf2/Bach1比率上调,HO-1表达增加,IL-1β和IL-18表达下降,跨格次数和直立次数增加,中央停留时间缩短,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论CORM-3可降低失血性休克复苏大鼠皮质神经细胞焦亡率,缓解认知功能障碍,其机制可能与上调Nrf2/Bach1比例后增加HO-1表达有关。

阿托伐他汀与一氧化碳供体分子3联用对动脉粥样硬化易损斑块模型大鼠炎症及氧化应激指标的影响

目的:研究阿托伐他汀与一氧化碳供体分子3(CORM-3)联用对动脉粥样硬化(AS)易损斑块模型大鼠炎症及氧化应激指标的影响。方法:取大鼠随机分为对照组(灌胃生理盐水)、模型组(灌胃生理盐水)、他汀组[灌胃阿托伐他汀2 mg/kg]、他汀+CORM-3组[灌胃阿托伐他汀2 mg/kg+腹腔注射CORM-3 10 mg/kg],每组8只。对照组大鼠予以基础饲料喂养,右颈总动脉只经历手术暴露但不予损伤并用生理盐水代替药物干预;其余3组大鼠均予以高脂饲料喂养+右颈总动脉损伤+异种蛋白注射刺激免疫炎症反应等方法复制AS易损斑块模型,继续饲养10周后,给予相应药物进行干预,每天1次,连续2周。末次给药24 h后取腹腔动脉血,使用全自动生化分析仪测定血浆中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)浓度,采用酶联免疫吸附试验检测血浆中超敏C反应蛋白(hs-CRP)、白细胞介素10(IL-10)、单核细胞超化蛋白1(MCP-1)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平,化学比色法测定血浆中丙二醛(MDA)、氧化修饰型低密度脂蛋白(ox-LDL)水平,Western blot法测定血红素氧合酶1(HO-1)蛋白表达水平,并取右颈总动脉在光镜下观察病理学变化。结果:与对照组比较,模型组大鼠LDL-C、hs-CRP、MCP-1、MMP-9、MDA、ox-LDL水平和HO-1蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),HDL-C、IL-10水平均明显降低(P<0.05),右颈总动脉形成明显的易损斑块。与模型组比较,他汀组和他汀+CORM-3组大鼠LDL-C、hs-CRP、MCP-1、MMP-9、MDA、ox-LDL水平均明显降低(P<0.05),HDL-C、IL-10水平和HO-1蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),其中除LDL-C、HDL-C外其余指标他汀+CORM-3组改善效果较他汀组更明显(P<0.05),他汀组颈动脉斑块改变尚不明显,但他汀+CORM-3组AS病变较模型组和他汀组显著减轻,斑块结构也更趋稳定。结论:阿托伐他汀与CORM-3联用对AS易损斑块模型大鼠炎症及氧化应激指标的改善作用强于单用阿托伐他汀,能促进AS易损斑块稳定。

小分子探针对光敏黄蛋白结构和动力学的研究

以二维红外光谱技术(2DIR)为主要的研究手段,以过渡金属羰基配合物CORM-3作为外源探针,研究了光敏黄蛋白(photoactive yellow protein,PYP)突变体M100A的超快结构动力学。结果表明,CORM-3以RuII(CO)2(RC)的形式稳定地结合在蛋白质的两个位点(H3和E81)上,并在红外光谱的羰基伸缩振动区域会产生四个吸收峰。2DIR结果表明两个结合位点存在不同的C≡O振动光谱扩散动力学,说明这两个结合位点处RC的水合程度以及蛋白质的局部结构环境不同。

一氧化碳释放分子3对缺氧/复氧心肌细胞内活性氧的影响

目的探讨一氧化碳释放分子3(CORM-3)对缺氧/复氧心肌细胞内活性氧(ROS)产生的影响。方法对大鼠H9c2心肌细胞缺氧6 h后,分别以10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的CORM-3复氧6 h,检测心肌细胞内ROS量,观察浓度效应。以50μmol/L CORM-3对缺氧6 h后的H9c2心肌细胞分别进行2 h、4 h、6 h、10 h复氧处理,检测心肌细胞内ROS量,观察时间效应。结果当CORM-3浓度为50μmol/L、100μmol/L时,心肌细胞内ROS量显著降低,其中50μmol/L的CORM-3效果更好,即ROS量下降最明显;当CORM-3浓度为200μmol/L时,心肌细胞内ROS量反而升高。50μmol/L CORM-3在复氧6 h、10 h都能显著降低H9c2心肌细胞的ROS量,其中复氧6 h的效果更好,即ROS量下降最明显。结论适当浓度的CORM-3能显著降低缺氧/复氧心肌细胞内ROS量。CORM-3降低缺氧/复氧心肌细胞内ROS量与复氧时间相关。