基于细胞模型的高通量药物筛选

随着高通量药物筛选发展的需要,细胞模型在药物筛选中发挥了越来越大的作用。本文综述了细胞模型在药物高通量筛选中的应用,主要介绍了该模型基础上的筛选流程、模型分类及其在实际药物筛选中的应用,并对其相关的检测技术进行了阐述,以及对其发展前景进行了分析。

维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的以维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型,用于筛选治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)、银屑病、痤疮以及肿瘤的新型药物。方法用分子生物学的方法,构建含有8个串连维甲酸受体应答元件(RARE)并连接报告基因E-GFP的重组载体。将体外培养的细胞株用该重组载体进行稳定转染,然后进行单克隆培养,最终挑选出敏感、高效、稳定表达的单克隆细胞,用于筛选针对维甲酸受体的小分子有机药物。结果建立了高效的药物筛选细胞模型。此模型筛选方法简便,适用范围广,灵敏度高,结果稳定。结论挑选出的细胞株作为药物筛选模型可用于大规模高通量药物筛选。

基于JAK/STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型的建立

目的 建立基于JAK STAT信号通路的高通量药物筛选细胞模型 ,筛选调节免疫系统、造血系统和抗肿瘤药物。方法 构建以串连的多个STAT的DNA结合序列为调控序列 ,以荧光酶基因作为报告基因的表达载体。通过将该载体分别转入体外培养的不同细胞系中使之稳定表达 ,建立具有激活STAT活性的药物筛选模型 ,并利用多个抗过敏和抗肿瘤药物样品进行检测。结果 建立多株药物筛选细胞模型 ,筛选方法简便 ,操作容易 ,灵敏度高 ,结果稳定。

高通量筛选瞬时受体势V3通道调节剂细胞模型的建立

为发现TRPV3调节剂,通过荧光成像分析系统检测钙浓度,建立高通量筛选瞬时受体势V3通道(Transient receptor potential V3,TRPV3)调节剂的细胞模型。将TRPV3表达载体转染人胚肾(HEK-293)细胞,抗生素筛选稳定表达TRPV3的细胞系,选取TRPV3特异性调节剂作用于细胞模型,应用荧光成像分析系统测钙实验检测TRPV3高表达细胞系药理学特征,同时优化实验条件,考察模型的稳定性,并评估应用于96孔板及384孔板进行高通量筛选的可靠性及准确性。获得了高表达TRPV3的HEK-293稳定细胞系,通过TRPV3离子通道调节的钙流信号与TRPV3特异性调节剂成剂量依赖关系,优化得到了最适筛选条件,该模型稳定,灵敏,通过Z因子及Spiking检测,完全符合高通量筛选需求。利用此细胞模型通过检测钙信号可筛选TRPV3调节剂。

基于CaCC的TRPV4调节剂高通量筛选细胞模型的建立

目的构建基于钙激活氯离子通道(CaCC)的瞬时受体电位香草酸亚型4(TRPV4)调节剂的高通量筛选细胞模型。方法采用RT-PCR检测Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中内源性表达的TRPV4,所得PCR产物切胶回收后测序;采用Western blotting检测FRT细胞中TRPV4蛋白的表达情况。应用脂质体转染法构建共表达钙激活氯离子通道蛋白1(ANO1)和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型,倒置荧光显微镜下观察ANO1和YFP-H148Q/I152L在细胞中的表达情况,应用荧光淬灭动力学实验测定细胞模型的有效性。加入TRPV4激活剂和抑制剂,应用荧光淬灭动力学实验检测模型能否筛选TRPV4调节剂;加入TRPV4激活剂,应用Fura-2荧光探针法检测细胞内的Ca2+浓度;通过Z'因子评估细胞模型是否适用于高通量筛选。结果RT-PCR和Western blotting检测结果显示,FRT细胞内源性表达TRPV4。倒置荧光显微镜下清晰可见ANO1表达在FRT细胞膜上,YFP-H148Q/I152L表达在FRT细胞质中,即成功构建了共表达ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT细胞模型。荧光淬灭动力学实验结果显示,该模型可以筛选TRPV4调节剂,斜率(Slope)值与TRPV4调节剂的浓度呈剂量依赖关系;该模型可敏感检测细胞内Ca2+的浓度变化,通过Slope值可反映细胞内Ca2+浓度的高低;Z'因子为0.728,表明该模型可高通量筛选TRPV4调节剂。结论成功构建了一种可以敏感高效筛选TRPV4调节剂的高通量筛选细胞模型。

细胞水平的高通量药物筛选技术研究进展

目的介绍细胞水平的高通量筛选技术研究进展。方法根据近年来文献,综述细胞水平的高通量技术发展趋势和使用技术进展。结果细胞水平筛选是在活细胞自然条件下,接近体内的生化过程,且可以做到多靶点、多指标检测,满足在药物发现早期对药物的综合评价,缩短药物发现周期。结论细胞水平的高通量筛选技术具有广阔前景。

钾通道调节剂的高通量筛选模型

目的 建立钾通道调节剂高通量筛选的细胞模型。方法 96孔板上细胞负载荧光染料DiBAC4(3 ) ,测定不同化合物对荧光强度的影响 ,反映细胞膜电位的变化 ,间接反映化合物对钾通道的作用。结果 高钾去极化和钾通道阻断剂 4 AP ,TEA ,E 40 3 1,glibenclamide ,quinidine和nifedipine均能增强细胞的荧光强度 ,钾通道开放剂cromakalim能减弱细胞的荧光强度 ,上述化合物在一定剂量范围内均有剂量效应关系。利用该模型筛选 76个化合物 ,发现 9个化合物的荧光强度变化值有较好的剂量效应关系 ,有待膜片钳技术的进一步验证和筛选。结论 此方法简单 ,易于操作 ,重现性好 。

CYP450表氧化酶激活剂高通量筛选模型的建立

目的：本研究拟建立以人细胞色素蛋白450（CYP450）表氧化酶激活剂的高通量筛选模型，用于发现能够调控EETs代谢的活性化合物，为新药研究提供源头。

基于膜电位检测原理的γ-氨基丁酸A型受体药物高通量筛选模型

目的利用膜电位检测原理,构建一种靶向γ-氨基丁酸A型受体(GABA_(A)R)的药物高通量筛选模型。方法采用α_(1)β_(2)γ_(2L)-GABA_(A)R-CHO细胞株构建GABA_(A)R药物高通量筛选方法;分别以工具化合物的50%激动效应浓度(EC_(50))和EC_(80)浓度下的激活值(ASV)和Z′因子作为判定指标,对缓冲液反应体系、激动剂GABA激活浓度、染料种类和染料孵育时间进行优化选择;在优化条件下分别利用激动剂GABA(0.05,0.25和1.00μmol·L^(-1))、阳性变构剂地西泮(Dia,1,5和30μmol·L^(-1))和拮抗剂加巴嗪(gabazine,Gab,0.1,1.0和10.0μmol·L^(-1))进行方法稳定性考察;通过工具化合物GABA,Dia和Gab的剂量-效应关系检测,考察方法灵敏度。结果构建的方法分别实现了对不同药理性质化合物GABA,Dia和Gab的特异性检测;通过方法优化获得的优化条件为:在GABAEC_(20)~EC_(50)激活浓度下,采用5μL含氯体系加样,对使用红色染料孵育30~50 min的GABAAR-CHO细胞进行工具化合物检测;对不同浓度GABA,Dia和Gab检测的CV%分别介于4.09%~15.30%,5.59%~8.30%和5.65%~15.64%;通过对3种工具化合物的剂量-效应关系检测,获得GABA和Dia的EC_(50)值分别为(137.4±26.3)nmol·L^(-1)和(3.5±0.7)μmol·L^(-1),Gab的50%抑制效应浓度为(164.9±36.6)nmol·L^(-1)。结论本研究建立并优化了高通量检测方法,该方法特异性好、精密度高、稳定可靠、灵敏度高,为靶向GABA_(A)R的先导化合物发现提供了良好的技术基础。

pcDNA3.1/hTSHR真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的 :构建pcDNA3.1(+)人促甲状腺激素受体 (hTSHR)基因真核表达载体 ,并在COS 7细胞中进行表达。方法 :以限制性内切酶EcoRI和XbaI双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR ,获得hTSHRcDNA的全长片段 ,在以低熔点琼脂糖回收纯化后 ,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的多克隆酶切位点中 ,构建重组体pcDNA3.1/hTSHR ,进行酶切、PCR及测序鉴定。通过脂质体介导 ,转染COS 7细胞进行瞬时表达 ,并用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测hTSHR的表达。结果 :双酶切pBluescriptSK(- ) /hTSHR得到约 2 70 0bp含TSHR全长cD NA的片段 ,同预期片段的大小相符。所构建的pcDNA3.1/hT SHR经双酶切及PCR鉴定同预期大小相符 ;测序结果与Gen Bank中收录的hTSHR全长序列一致 ,表明真核表达质粒构建正确。以脂质体转染COS 7细胞后 ,用RT PCR和免疫细胞化学染色法检测表明 ,细胞可表达hTSHR。结论 :成功地构建真核重组表达质粒pcDNA3.1/hTSHR ,为进一步研究TSHR的功能 ,以及利用hTSHR真核表达载体建立Graves实验动物模型奠定了基础。

白细胞介素1受体拮抗剂筛选模型研究

以链霉菌表达的重组 hs IL- 1R 为靶位 ,建立了基于受体配基竞争性结合为原理、白细胞介素 1受体拮抗剂筛选模型 ,对 5 0 0株微生物发酵产物进行了筛选 ,复筛阳性率为 4%～ 5 % ,该模型具有新颖性和实用性。

FoxO1抑制剂细胞筛选模型的构建与应用

目的构建含有人叉头框蛋白O1(FoxO1)结合靶位点(即胰岛素反应元件,IRE)的以萤火虫荧光素酶(Luc2)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为双报告基因的FoxO1抑制剂高通量筛选细胞模型,进行FoxO1抑制剂的筛选,并对获得的阳性化合物细胞活性进行初步研究,以期获得能够调节糖脂代谢紊乱相关疾病的先导化合物或候选药物。方法用分子生物学的方法,构建含有胰岛素反应元件的并连接Luc2和EGFP双报告基因的重组载体pc-IRE-LE。将体外培养的HEK293T细胞用该重组载体进行瞬时转染,分别利用萤火虫荧光素酶试剂盒和荧光显微镜对荧光素酶活性及绿色荧光蛋白表达进行检测,从而构建细胞模型并对其进行进一步优化和评价。应用该细胞模型对化合物库进行高通量筛选,随后利用实时定量RT-PCR的方法对筛选获得的阳性化合物的FoxO1抑制剂活性,即对FoxO1多个糖脂代谢相关靶基因mRNA表达进行检测。结果成功构建了具有Luc2和EGFP双报告基因的FoxO1抑制剂高通量筛选细胞模型,并完成了模型评价。经过对6000余个化合物的筛选,共获得6个具有明显的剂量-效应关系的阳性化合物。其中化合物7625-H9在模型上表现出良好的FoxO1抑制剂活性,并在细胞上对FoxO1多个靶基因PEPCK、G6Pase、apoC-Ⅲ和MTP的mRNA水平均有显著的抑制作用。结论该模型符合高通量筛选的要求,可用于FoxO1抑制剂的高通量筛选。该模型的应用将为新型调节糖脂代谢紊乱药物的发现提供一个可靠而有效的方法。

基于细胞的TMPRSS2抑制剂高通量筛选模型建立与应用

跨膜丝氨酸蛋白酶2 (transmembrane serine protease 2,TMPRSS2)是人体中广泛存在的细胞表面蛋白,参与严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)等多种病毒的感染和前列腺癌细胞侵袭、肿瘤生长和转移过程等。本研究使用Boc-Gln-Ala-Arg-AMC作为表征TMPRSS2切割活性的底物,在过表达TMPRSS2的Vero E6细胞(Vero E6/TMPRSS2)中建立了TMPRSS2抑制剂细胞筛选模型,通过对国家新药(微生物)筛选实验室天然与合成化合物纯品库进行高通量筛选,得到了7个具有TMPRSS2抑制活性的低毒化合物。表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)检测证明所得抑制剂均可与TMPRSS2发生中等强度的结合,且呈现浓度依赖性;细胞-细胞融合实验表明,所得抑制剂可通过抑制TMPRSS2切割SARS-CoV-2 S蛋白,抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导的细胞-细胞融合的发生,呈现浓度依赖性;假病毒活性评价结果显示,小分子抑制剂对野生型SARS-CoV-2假病毒感染Opti-HEK-293T-ACE2受体细胞表现出不同程度的抑制活性。本研究成功建立了细胞模型用于TMPRSS2抑制剂的高通量筛选,并初步证实筛选所得的抑制剂具有体外抗TMPRSS2活性的作用,为抗SARS-CoV-2的新药研发提供了新结构骨架。

Caco-2细胞模型在药物体外研究中的应用

Caco-2细胞模型是一种筛选药物离体口服特性的模型,已广泛用于评价药物在小肠的吸收特性和各种转运机制的研究。现综述Caco-2细胞单层模型的基本特点及其在药物的小肠吸收、代谢以及高通量筛选等方面的应用。

三维高通量肝细胞芯片模型的构建及其在中药肝毒性评价中的应用

本研究构建了一种高通量三维肝细胞模型,可模拟细胞在体内的三维生长空间,具有通量高、精密度好、成本低、操作简便的优势,可用于中药肝毒性的快速评价。首先,采用胶原水凝胶构建了三维高通量肝细胞芯片模型,以对乙酰氨基酚、昆明山海棠提取物和中药复方七厘散提取物为参照,对模型的精密度及与二维孔板模型的差异进行了考察,并对四个批次的昆明山海棠和复方七厘散提取物的肝毒性进行了评价,考察了方法的适用性。方法学考察结果显示,该模型的精密度和适用性良好,优于传统的二维孔板。接着,在三维肝细胞芯片模型上对不同样品给药3或7天的肝毒性进行了比较,发现中药成分的肝毒性随着给药时间的延长而增强。最后,对等生药量的单味中药昆明山海棠和复方中成药昆仙胶囊进行了肝毒性比较,发现中药配伍可以显著降低昆明山海棠的肝毒性。综上,本研究建立了一种高通量、稳定可靠的三维肝细胞芯片模型,可用于中药肝毒性的快速评价。

应用诱导多能干细胞构建体外神经退行性疾病模型的研究进展

随着细胞重编程技术的不断发展,诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)向不同类型体细胞定向分化的技术已经日趋成熟。由于许多疾病或易感体质具有其独特的遗传信息,因而使用来自具有不同疾病类型的捐赠者体细胞,可以重编程为一系列具有特定致病基因背景的iPSCs库。根据需要可以将其直接分化为能够产生该疾病表征的细胞谱系或亚型。这些细胞由于带有捐赠者的基因特征,因而能够在体外表现出与体内实际病理特征相似的疾病模型。目前已有超过15种此类疾病模型的新药筛选报道。虽然尚不成熟,但我们已经可以预见该方法在药物筛选中巨大的发展潜力。该文总结了以iPSCs作为基础,针对神经退行性疾病所进行的疾病模型的建立。对比传统方法,分析了其在新药高通量筛选(high-throughput screening,HTS)以及高内涵筛选(high-content screening,HCS)中的应用前景。

基于CFTR的H2受体调节剂高通量筛选细胞模型的构建

目的建立基于囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, CFTR)高通量筛选组胺H2受体(histocompatibility-2)调节剂的模型。方法应用RT-PCR、Western blot检测H2受体在Fischer大鼠甲状腺滤泡上皮(FRT)细胞中表达情况。采用脂质体转染获取同时表达CFTR和黄色荧光蛋白双突变体YFP-H148Q/I152L的FRT细胞。荧光淬灭动力学实验检测细胞模型功能,判断该模型是否可以筛选H2受体的调节剂。结果 RT-PCR、Western blot结果显示,FRT内源性表达H2受体。采用倒置荧光显微镜观察,证实成功构建同时表达CFTR和YFP-H148Q/I152L的细胞模型。荧光淬灭动力学实验证明该模型具有cAMP激活氯离子通道的特性,可用于H2受体调节剂的筛选,且荧光斜率(slope)值与H2受体调节剂的浓度呈剂量依赖关系。结论成功构建基于CFTR高通量筛选H2受体调节剂的细胞模型。

基于COL1A1启动子的抗肝纤维化药物高通量筛选模型的建立及应用

为了有效筛选潜在的抗肝纤维化药物,本实验室建立了基于COL1A1启动子的高通量筛选细胞模型。该细胞模型在TGF-β1的刺激下,激活COL1A1启动子及荧光素酶报告基因的表达,而该激活作用可以被候选化合物抑制。作者首先构建COL1A1启动子和荧光素酶报告载体p GL4.17的重组质粒。采用双荧光素酶报告基因检测系统对该启动子的活性进行检测,发现重组质粒比对照组荧光素酶活性高15.98倍。该质粒转染到人肝星状细胞株LX2中,用无限稀释法得到单克隆细胞株,并利用活体成像仪筛选出稳定表达COL1A1启动子的单克隆细胞株LX2-COL。经TGF-β1诱导后检测该单克隆细胞株LX2-COL对候选化合物（S1~S7）的反应性,其中S7对启动子活性抑制作用最强。Real-time RT-PCR和Western blotting验证了经该细胞模型筛选得到的化合物S7能够抑制Ⅰ型胶原m RNA和蛋白水平的表达。结果表明,该细胞模型的建立能够实现对潜在的抗肝纤维化化合物的高通量筛选。