miR-133b靶向调控FOXL2对COV434细胞迁移增殖的影响

目的建立miR-133b在人卵巢颗粒肿瘤细胞(COV434)中的过表达模型,探讨其对FOXL2基因表达的影响,及其对COV434细胞的迁移增殖的作用。方法以生物信息学方法分析miR-133b是否靶向作用于FOXL2基因的UTR区域,依据预测结果设计合成靶向FOXL23′UTR的miR-133b mimics,运用脂质体法将miR-133b mimics瞬时转染入COV434细胞中,观察荧光以确定转染时间;miR-133b mimics转染人卵巢颗粒肿瘤细胞后,使用qRT-PCR检测COV434细胞中FOXL2基因mRNA的表达水平,使用Western Blot法检测FOXL2蛋白表达水平,细胞划痕试验检测miR-133b转染后COV434细胞的迁移情况,MTT法检测miR-133b转染后COV434细胞的增殖情况。结果miR-133b作用于FOXL2 mRNA的3′UTR区域,阴性对照组与空白对照组比较,COV434细胞FOXL2基因mRNA和蛋白的表达水平均无统计学差异(P>0.05),而miR-133b转染组与阴性对照组和空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05),提示miR-133b能显著抑制FOXL2 mRNA和蛋白的表达。同时,miR-133b转染COV434细胞后亦能明显抑制COV434细胞的迁移与增殖。结论miR-133b可抑制COV434细胞FOXL2 mRNA和蛋白的表达,进而抑制COV434细胞的迁移和增殖。

人卵巢颗粒肿瘤细胞COV434中抗苗勒氏管激素抑制干细胞生长因子表达的实验研究

目的探讨人卵巢颗粒肿瘤细胞COV434中AMH对SCF表达的抑制作用。方法用课题组前期已构建及鉴定成功转染AMH真核表达载体p IRES2-EGFP-AMH的COV434细胞系作为实验组,将空质粒载体转染的COV434细胞系作为阴性对照组;未经转染的COV434系作为空白对照组,分别采用Western blot和免疫荧光法检测不同干预组SCF蛋白的表达水平。结果1Western blot实验结果显示转染AMH真核表达载体p IRES2-EGFP-AMH的COV434中AMH表达较空白对照组和阴性对照组明显增强(P<0.05),阴性对照组和空白对照组无统计学差异(P>0.05)。2Western blot实验结果显示SCF在实验组表达较空白对照组和阴性对照组显著降低(P<0.05)。3免疫荧光实验结果显示SCF在实验组的平均光密度值较阴性对照组及空白对照组的表达显著升高(P<0.05)。结论人卵巢颗粒肿瘤细胞COV434中AMH能有效抑制SCF蛋白的表达,为颗粒细胞中AMH调控SCF机制的研究提供科学基础。

siRNA干扰AMH基因对人卵巢颗粒肿瘤细胞COV434中SCF表达的影响

目的研究siRNA干扰AMH基因对人卵巢颗粒肿瘤细胞COV434中SCF表达的影响。方法针对AMH设计合成的4条siRNA分别转染COV434细胞,RT-PCR法检测AMH mRNA表达的变化,筛选出其中沉默AMH基因最高效的siRNA;用RT-PCR法联合免疫荧光化学法(IHC)检测该siRNA干扰AMH基因对COV434细胞中SCFmRNA和蛋白表达的影响。结果 14条siRNA均使细胞中AMH的mRNA表达降低(P<0.05),以AMH-4-siRNA沉默效果最好。2AMH-4-siRNA转染组的SCFmRNA表达量(1.3472)明显高于空白组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05);空白组和阴性对照组SCFmRNA差异无统计学意义(P>0.05)。3 AMH-4-siRNA组SCF蛋白相对表达量(0.342±0.052)较空白组(0.246±0.065)和阴性对照组(0.248±0.072)显著增高,差异有统计学意义(P<0.05),空白组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论构建siRNA可有效干扰COV434细胞AMH的表达,应用siRNA干扰AMH基因能够促进人卵巢颗粒肿瘤细胞COV434中SCF的表达。

过氧化氢诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的建立

目的探讨构建过氧化氢(H_2O_2)诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的方法。方法不同浓度H_2O_2处理人卵巢颗粒细胞COV434,采用Western blot检测Caspase-3表达,流式细胞仪和DAPI/TUNEL双染色法检测细胞凋亡情况,H2DCF-DA检测细胞内活性氧族(ROS)水平,通过量效关系和时效关系来确定H_2O_2的最佳作用条件。结果 1~1.5 mmol/L浓度H_2O_2处理COV434细胞2~4h后Caspase-3表达量升高最明显。随着H_2O_2浓度增加及作用时间的延长细胞凋亡率不断升高。细胞内ROS水平随着H_2O_2浓度的增加而增加。1.5mmol/L浓度H_2O_2处理1h后细胞内ROS水平上升最明显。结论 H_2O_2诱导人卵巢颗粒细胞氧化应激模型的最适宜浓度为1~1.5 mmol/L,采用细胞凋亡情况评价作用时间是2~4h,采用ROS评价作用时间为1h。

MAPKs和Nrf2/ARE通路调控卵巢颗粒细胞氧化应激的机制研究

目的运用过氧化氢(H_2O_2)制作人卵巢颗粒细胞(COV434)氧化应激模型,通过检测氧化应激MAPKs和抗氧化应激Nrf2/ARE通路的变化,探讨COV434氧化应激的机制。方法研究不同H_2O_2浓度(0.5、1、1.5 mmol/L)和不同作用时间(1、2、4、6及12 h)梯度下,MAPKs家族中ERK、P38及JNK蛋白及其磷酸化的表达水平,Nrf2/ARE通路中Nrf2、keap1和P62蛋白表达水平。结果在H_2O_21.5 mmol/L浓度作用下,COV434细胞内p-ERK、p-P38、p-JNK在1 h表达最强;在不同浓度H_2O_2作用4 h后,p-ERK不随浓度的变化而变化,然而p-P38、p-JNK随浓度的增加表达增强;Nrf2蛋白表达随着H_2O_2作用时间的延长和浓度的增加逐渐增强;Keap1在H_2O_21.5 mmol/L浓度作用下,随着时间延长蛋白表达轻度下降,而P62的蛋白表达轻度上升;在不同浓度H_2O_2作用4 h下Keap1变化不明显,而P62表达稍微增强。结论 MAPKs 3个亚族均参与了H_2O_2诱导COV434氧化应激过程,氧化应激可以诱导细胞内Nrf2的蛋白表达,提示Nrf2/ARE通路在COV434自我抗氧化中发挥作用。

M-CSF对人卵巢颗粒细胞表达FSH与其受体的影响及相互作用研究

目的通过研究巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)对卵巢颗粒细胞表达卵泡刺激素(FSH)与其受体(FSHR)的影响及其与FSH之间的相互作用,探讨M-CSF在卵泡发育中的作用。方法体外培养人卵巢肿瘤颗粒细胞系COV434,分别给予不同浓度的M-CSF(0、5、10、25、50、100ng/ml)进行干预,24h后收取细胞和培养上清液,用荧光定量PCR法检测颗粒细胞内FSH受体表达量的变化,并用同法检测FSH对M-CSF及其受体M-CSFR的作用。用ELISA方法对上清液中细胞分泌的雌二醇(E_2)进行检测,观察M-CSF对颗粒细胞分泌E_2的影响。结果 M-CSF可使颗粒细胞FSHR的表达上升,呈剂量依赖性,当M-CSF浓度>10ng/ml时,上升更为明显(P<0.01);FSH可以提升M-CSF及其受体在颗粒细胞内的表达,但当FSH浓度过高时(>50ng/ml),此作用消失;M-CSF和FSH在体外条件下达到一定浓度后可以促进E_2的分泌。结论 M-CSF能够促进颗粒细胞表达FSH受体和分泌E_2,协助FSH发挥促卵泡发育的作用。

Chemerin对卵巢颗粒细胞的影响及对PCOS发病机制的研究

目的:探究Chemerin在多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)发病机制中的作用。方法:体外培养人卵巢颗粒细胞(COV434),分别下调及过表达COV434细胞中的Chemerin基因,采用ELISA测定培养液炎性因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、白介素-10(interleukin-10,IL-10)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)浓度,EdU方法测定各组细胞增殖能力,流式细胞法测定细胞凋亡。结果:下调组(LV3-shChemerin-1、LV3-shChemerin-2)与阴性对照组(LV3-NC)相比,培养液中IL-6、IL-8、TNF-α浓度均明显降低,IL-10浓度明显升高,差异均有统计学意义(PIL-6=0.006,PIL-8=0.001,PTNF-α=0.012,PIL-10=0.002),颗粒细胞COV434增殖能力明显降低(P=0.004),凋亡明显增加(P=0.000)。过表达组(LV5-Chemerin)与阴性对照组(LV5-NC)相比,培养液中IL-6、IL-8、TNF-α明显升高,IL-10明显降低,差异均有统计学意义(PIL-6=0.044,PIL-8=0.008,PTNF-α=0.015,PIL-10=0.004),颗粒细胞COV434增殖能力明显提高(P=0.013),凋亡明显降低(P=0.029)。结论:Chemerin可能通过促进卵巢颗粒细胞炎症反应,并诱导颗粒细胞增殖抑制凋亡参与PCOS的发生发展。

真核表达载体pIRES2-EGFP-AMH的构建及鉴定

目的构建人AMH基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-AMH。方法从COV434细胞中获取AMH基因片段,经EcoRI、BglII双酶切定向克隆至载体pIRES2-EGFP,构建pIRES2-EGFP-AMH。经双酶切和测序鉴定后转染COV434细胞,通过荧光定量PCR和细胞免疫荧光技术检测AMH基因的表达变化。结果重组人AMH真核表达质粒经酶切和测序鉴定正确,转染后能显著提高AMH mRNA和蛋白的表达。结论人AMH真核表达载体构建成功,为进一步研究人AMH基因的功能提供初步的实验基础。

囊性纤维化跨膜转导因子与多囊卵巢综合征发病机制的相关性研究

目的:通过观察囊性纤维化跨膜转导因子(CFTR)对人源卵巢颗粒肿瘤细胞(COV434)增殖活力和凋亡等生物学特性的影响,探讨CFTR与多囊卵巢综合征(PCOS)排卵障碍发病机制的相关性,为PCOS提供新的病因诠释及防治靶点。方法:在CFTR特异性阻滞剂CFTRinh-172干预下,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察COV434细胞的增殖活性及凋亡情况,利用Western Blot检测COV434细胞中半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶(Cleaved-Caspase3)蛋白、环氧化酶-2(COX-2)蛋白的表达情况,利用PCR检测肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)基因的表达情况。结果:不同浓度(10μmol/L和50μmol/L)CFTRinh-172阻滞剂作用于COV434细胞后均致其生长活力下降,且随浓度的增加其生长抑制显著,CFTRinh-172阻滞剂处理72h后的COV434细胞生长抑制率差异列更显著,抑制率与作用时间显著正相关;不同浓度(1μmol/L和10μmol/L)CFTRinh-172阻滞剂作用COV434后,Cleaved-Caspase3和COX-2的蛋白表达量随浓度的增加而增加,其中,Cleaved-Caspase3的蛋白表达量在培养48h后明显高于培养24h后;添加不同浓度(1μmol/L和10μmol/L)CFTRinh-172阻滞剂后,COV434中TRAIL基因的24h表达量与对照组相比呈低表达,且随着浓度的增加抑制效果更显著。结论:CFTR缺失通过Cleaved-Caspase3、COX-2及TRAIL分别影响卵巢颗粒细胞的凋亡、血管生成及卵巢内炎症反应,从而推测CFTR缺失可能是多囊卵巢综合征的卵泡发育异常的重要病理生理改变和发病机制之一。