Ras分子信号蛋白调控睾丸间质细胞Cox7a2蛋白表达及共定位影响研究

目的:研究Cox7a2与Ras分子蛋白的共定位特点,探讨迟发性性腺功能障碍(late onset hypogonadism,LOH)的分子信号调控机制。方法:构建Cox7a2及Ras正义及点突变体荧光表达载体,鉴定后转染细胞,荧光显微镜观察Cox7a2及Ras蛋白的共定位特点。结果:Cox7a2的线粒体定位能被Wt-Ras所干扰,N17-Ras突变体转染细胞,Cox7a2恢复线粒体定位,提示Cox7a2和N17-Ras之间可能存在相互作用。结论:Cox7a2对睾酮合成的调控可能与Ras相关信号通路有关,Ras可能是调控靶点之一。

Cox7a2在TM3睾丸Leydig细胞中表达,定位及与ERK1/2磷酸化相关性研究

目的:研究Cox7a2的荧光表达载体在TM3睾丸Leydig细胞中的表达和定位及对ERK1/2磷酸化的影响。方法:将Cox7a2克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜观察其在TM3细胞中的表达和定位,Westernblot检测ERK1/2磷酸化水平。结果:在TM3细胞中,绿色荧光YFP-Cox7a2和红色荧光线粒体标记物-Mitotracker有完全的共定位,过量表达YFP-Cox7a2能引起ERK1/2磷酸化水平增高。结论:成功表达了YFP-Cox7a2融合蛋白,确认了其在TM3细胞的线粒体定位。YFP-Cox7a2过表达和ERK1/2磷酸化水平有联系,为探讨Cox7a2对TM3细胞睾酮分泌及其相关信号传导通路的影响奠定了基础。

重组蛋白Cox7a2原核表达及鉴定

目的:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7a2基因,构建pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达和鉴定重组蛋白。方法:应用RT-PCR方法从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞中克隆Cox7 a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点把Cox7a2克隆到pGEX4T-1载体,酶切和测序鉴定后,诱导重组蛋白的表达,进行纯化后,利用蛋白免疫印迹进行鉴定。结果:从原代培养的小鼠睾丸Leyd ig细胞克隆到Cox7a2完整的编码序列,构建了pGEX4T-1-Cox7 a2载体,表达了预期相对分子质量的融合蛋白,并经免疫印迹检测鉴定。结论:成功克隆Cox7a2,表达纯化了其融合蛋白,为基因的功能研究奠定了前期基础。

自噬信号因子P70S6K参与Cox7a2调控睾酮生成机制研究

目的:研究Cox7a2对TM3 Leydig细胞睾酮生成的影响以及涉及其中的自噬调控信号的作用。方法:构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3 Leydig细胞。ELISA测定睾酮水平,Western印迹检测Cox7a2对睾酮合成快速调节蛋白StAR表达和自噬调控因子P70S6K磷酸化水平的影响。结果:在TM3 Leydig细胞中,LH刺激能增加促进StAR蛋白表达,增加睾酮合成水平。Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中抑制P70S6K磷酸化水平,降低StAR蛋白的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成。结论:Cox7a2通过抑制快速调节蛋白StAR的表达减少LH诱导的睾酮分泌,这至少和Cox7a2抑制自噬调控因子P70S6K有关。

罕见COX7A2L-ALK融合突变晚期肺腺癌1例病例报告并文献复习

肺癌是全世界发病率和死亡率最高的肿瘤,随着下一代测序(next generation sequencing,NGS)检测技术的发展,越来越多的罕见间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)融合突变患者被检测出来。本文报道了北京协和医院收治的1例罕见COX7A2L-ALK(C2:A20)融合突变的肺腺癌晚期患者,同时检索2014年1月1日-2021年3月31日发表的罕见ALK融合突变的病例报道,探讨ALK抑制剂对罕见ALK融合突变患者的疗效。本例患者一线给予口服塞瑞替尼后病情好转,疗效评价为部分缓解(partial response,PR)。通过上述检索方法检索出符合文献19篇,共报道22例罕见ALK融合突变,结合本例,对23例进行汇总分析。分析结果显示,ALK抑制剂对罕见ALK融合突变的客观有效率为82.6%(19/23),疾病控制率为95.7%(22/23)。罕见ALK融合突变晚期肺腺癌患者可以从ALK抑制剂治疗中受益。

Cox7a2 mediates steroidogenesis in TM3 mouse Leydig cells

Aim： To investigate the regulatory function of Cox7a2 on steroidogenesis and the mechanism involved in TM3 mouse Leydig cells. Methods： The cDNA of Cox7a2 was cloned from TM3 mouse Leydig cells. It was subcloned to pDsRed- Express-N 1 and transfected back into TM3 mouse Leydig cells for Cox7a2 overexpression by transient gene transfection. Steroidogenesis affected by overexpressed Cox7a2 was studied by ELISA. To elicit the mechanism of this effect, expression of steroidogenic acute regulatory （STAR） protein and reactive oxygen species （ROS） were examined by Western blot and fluorometer, respectively. Results： The cDNA of Cox7a2 （249 bp） was cloned from Leydig cells and confirmed by DNA sequencing. After constructed pDsRed-Express-N1-Cox7a2 was transfected back into TM3 mouse Leydig cells, Cox7a2 inhibited not only luteinizing hormone （LH）-induced secretion of testosterone but also the expression of StAR protein. At the same time, Cox7a2 increased the activity of ROS in TM3 mouse Leydig cells. Conclusion： Cox7a2 inhibited LH-induced StAR protein expression, and consequent testosterone production, at least in part, by increasing ROS activity in TM3 mouse Leydig cells.

Construction of Cox7a2 fluorescent vector and its effect on cytochrome C oxidase activity in mouse Sertoli cell line TM4

Objective To construct Cox7a2 fluorescent vector and study its effect on cytochrome C oxidase ( COX) activity in mouse Sertoli cell line TM4. Methods The coding region of CoxTa2 was amplified from mouse Sertoli cell line TM4 by RT-PCR. PCR product was

Cox7a2对睾酮合成及StAR、P450scc和3β-HSD蛋白表达影响研究

目的研究Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leyidg细胞中过农达对LH诱导的睾酮合成及对StAR(睾酮合成调节关键蛋白),P450scc(胆同醇侧链裂解酶),3β—HSD(3β-羟基甾脱氢酶)蛋白表达的影响。方法构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞,融合蛋白表达及LH诱导刺激后,ELISA测定细胞上清液中睾酮含量,Western blot检测StAR蛋白、P450scc和3β-HSD酶的表达变化。结果Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中过表达抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,对P450scc和3β-HSD的蛋白表达没有明显影响。结论在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,Cox7a2至少通过抑制类固醇快速调节蛋白StAR的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成。

Cox7a2通过ROS调控睾丸Leydig细胞睾酮生成的研究

目的研究Cox7a2调控睾酮生成的影响及其机制。方法构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞。ELISA法测定上清液中睾酮含量,Western blot检测类固醇合成快速调节蛋白StAR表达,荧光分光光度计检测ROS水平。结果 Cox7a2抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,升高ROS水平。结论 Cox7a2通过抑制类固醇合成快速调节蛋白StAR的表达调控睾酮分泌,至少和增高ROS水平有关。

Cox7a2和ATP50在原代培养小鼠Leydig细胞和人体不同器官的表达研究

目的研究线粒体呼吸链相关基因Cox7a2,ATP50在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞和人体各器官组织中的表达特征。方法原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并鉴定,利用RT-PCR方法研究Cox7a2,ATP50在Leydig细胞中的表达。利用PCR方法研究Leydig在人体各重要脏器组织的表达谱。结果Cox7a2,ATP50在原代小鼠睾丸Leydig细胞中表达,Cox7a2和ATP50在各个脏器呈现出不同的表达特征。结论Cox7a2, ATP50表达在原代小鼠睾丸Leydig细胞中,研究Cox7a2,ATP50在人体各器官的表达特点,为基因的功能研究奠定了前期基础。

Cox7a2荧光载体构建及其在小鼠睾丸Leydig细胞表达和定位研究

目的构建Cox7a2的荧光表达载体,研究其在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达和定位。方法原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并利用3β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达。利用BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点把Cox7a2克隆到pEYFP-N1。细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-Cox7a2定位。结果Cox7a2表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中。绿色荧光的YFP-Cox7a2和红色荧光的线粒体标记物- Mitotracker有完全的共定位。结论Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建Cox7a2真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-Cox7a2定位在Leydig细胞的线粒体。这些结果将对老年男性睾丸间质细胞合成功能障碍的研究提供重要的信息。

Cox7a2荧光载体构建及其对小鼠支持细胞细胞色素C氧化酶活性的影响

目的构建pEYFP-Cl-Cox7a2表达载体，研究其在小鼠睾丸支持细胞（TM4）中的表达及对细胞色素C氧化酶（COX）活性的影响。方法应用RT—PCR方法从TM4细胞克隆Cox7a2，利用BamHI和EcoRI酶切位点将Cox7a2克隆到pEYFP—C1载体，经酶切、测序及蛋白印迹等技术进行鉴定，并将重组质粒pEYFP—C1-Cox7a2转染TM4细胞后6、12、24、48h，采用分光光度计测定COX活性。结果从TM4细胞克隆到Cox7a2基因完整的编码序列，大小为252bp。构建pEYFP—CI．Cox7a2表达载体，经酶切、测序鉴定证实克隆正确，转染TM4细胞的效率达70％，融合蛋白表达产物相对分子质量为37000。重组质粒转染后6、12、24、48h时COX活性分别为（0．642±0．051）、（0．542±0．049）、（0．311±0．021）和（0．216±0．010）U／mg，不转染组和转染空载体组分别为（0．714±0．064）、（0．653±0．031）U／mg。与不转染组相比，重组质粒转染后12、24、48h组COX活性显著降低（P〈0．05）。结论重组质粒pEYFP—Cl-Cox7a2载体成功构建。CoxTa2基因对TM4细胞COX活性具有抑制作用，可能对调控COX活性发挥重要作用。

转染Cox7a2重组质粒对大鼠支持细胞分泌功能和ERK磷酸化水平的影响

目的：观察大鼠睾丸支持细胞转染细胞色素C氧化酶7a2（Cox7a2）重组质粒后对支持细胞分泌功能及细胞外信号调节激酶（ERK）磷酸化水平的影响。方法培养原代大鼠睾丸支持细胞，将细胞分为空白对照组、空载体组、重组质粒组。将pEGFP-C1-Cox7a2重组质粒转染支持细胞24h后，收集细胞上清液，采用酶联免疫法，测定转铁蛋白（TF）、白细胞介素-1（interleukin-1, IL-1）β、白细胞介素-6（IL-6）含量。Western blot检测ERK的磷酸化水平。结果重组质粒组TF为（14.11±0.45）pmol/mL，显著低于空白对照组（24.3±0.64）pmol/mL和空载体组（25.16±0.42）pmol/mL（P＜0.01）。重组质粒组IL-1β、IL-6水平分别为（157.14±12.69）pg/mL、（0.79±0.04）pg/mL，显著高于空白对照组（33.05±1.92）pg/mL、（0.25±0.01）pg/mL和空载体组（40.46±6.69）pg/mL、（0.37±0.03）pg/mL，差异均具统计学意义（P＜0.01）。与空白对照组和空载体组相比，重组质粒组ERK1/2磷酸化水平明显增高（P＜0.01）。结论转染Cox7a2重组质粒后损害了大鼠睾丸支持细胞的分泌功能，提高ERK1/2磷酸化水平。

五子衍宗丸含药血清对大鼠睾丸支持细胞分泌产物的影响

目的:探讨五子衍宗丸含药血清对大鼠睾丸支持细胞分泌产物的影响及其作用机制。方法:制备五子衍宗丸含药血清,分离培养大鼠睾丸支持细胞,构建Cox7a2重组质粒,将Cox7a2重组质粒转染的支持细胞和五子衍宗丸含药血清共孵育,收集细胞上清液,采用ELISA法测定雄激素结合蛋白(ABP)、转铁蛋白(TF)、抑制素B(INHB)、IL-1β和IL-6含量。结果:与正常细胞组相比,转染Cox7a2重组质粒后支持细胞上清液中ABP、IL-1β、IL-6水平显著升高,TF、INHB显著降低(P<0.05);给予五子衍宗丸高浓度含药血清共孵育后,转染重组质粒后升高的ABP、IL-1β和IL-6水平显著降低,而降低的TF、INHB水平显著升高(P<0.05)。结论:Cox7a2的过表达可干扰支持细胞分泌功能,而五子衍宗丸含药血清对支持细胞分泌产物的改善作用与抑制Cox7a2的表达有关。

Atp50和coxⅦa在大鼠Leydig细胞中的表达与鉴定

目的前期研究发现呼吸链相关酶cox7A2和Atp合成酶亚单位Atp50在青年和老年睾丸组织中存在明显表达差异。本研究观察两者同源序列Atp50和coxⅦa在原代培养的大鼠Leydig细胞中的表达情况,为其在雄激素合成和睾丸衰退中的作用研究奠定基础。方法分离培养大鼠Leydig细胞,提取细胞总RNA,通过RT-PCR扩增目的片断,PCR产物进行TA克隆、测序鉴定。结果RT-PCR可见Atp50和coxVIIa表达,目的片段大小分别是438bp和358bp。PCR产物片段TA克隆测序结果与原序列一致率分别为99．7%和99．8%。结论RT-PCR和TA克隆测序结果证明大鼠睾丸Leydig细胞中存在coxVIIa和Atp50表达,对于其可能参与调节睾酮合成过程则有待于进一步研究。