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微小隐孢子虫CP15/60-DNA滴鼻免疫小鼠诱导的粘膜与系统免疫反应 被引量:6
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作者 何宏轩 张西臣 +2 位作者 尹继刚 李建华 杨举 《中国农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第5期112-116,共5页
为了观察微小隐孢子虫表面蛋白基因的重组质粒 pc DNA3- 15 /6 0诱导机体产生的免疫应答情况 ,用重组质粒经鼻粘膜接种 BAL B/c小鼠 ,采用淋巴细胞转化实验、流式细胞仪、EL ISA和免疫组化染色法检测了其诱导的系统和粘膜免疫反应 ,并... 为了观察微小隐孢子虫表面蛋白基因的重组质粒 pc DNA3- 15 /6 0诱导机体产生的免疫应答情况 ,用重组质粒经鼻粘膜接种 BAL B/c小鼠 ,采用淋巴细胞转化实验、流式细胞仪、EL ISA和免疫组化染色法检测了其诱导的系统和粘膜免疫反应 ,并在免疫后经口接种微小隐孢子虫卵囊。结果为免疫小鼠淋巴细胞增殖反应二免后 SI均大于 2 (P<0 .0 1) ;免疫后 ,CD+ 4 T细胞增加了 (32 .4 2± 2 .19) % (P>0 .5 ) ,CD+ 8T细胞增加了(2 6 .73± 3.33) % (P<0 .5 ) ;小肠粘膜 Ig A分泌型浆细胞数增加了 94 .3± 6 .3;血清中 Ig G和小肠液中 Ig A滴度分别提高了 0 .6 8± 0 .0 6和 0 .77± 0 .0 5 (P<0 .0 1) ;实验组小鼠排出卵囊减少了 2 .2倍 ,排卵时间缩短了4 .5 d(P<0 .5 )。研究表明重组质粒诱导机体产生多种免疫反应 。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 cp15/60-dna 滴鼻免疫 小鼠 诱导 系统免疫反应 粘膜免疫 核酸疫苗
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微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因的克隆与原核表达 被引量:5
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作者 于慧珠 陈兆国 +2 位作者 岳城 米荣升 夏延富 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2008年第8期670-675,共6页
提取微小隐孢子虫鼠基因型卵囊总RNA,用RT-PCR扩增微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因并克隆到pMD18-T载体中。将鉴定正确的序列亚克隆于原核表达载体pET-28b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western-... 提取微小隐孢子虫鼠基因型卵囊总RNA,用RT-PCR扩增微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15/60基因并克隆到pMD18-T载体中。将鉴定正确的序列亚克隆于原核表达载体pET-28b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析,同时将重组蛋白免疫动物后检测血清抗体。结果显示,克隆的目的基因核苷酸序列与GenBank登录的序列的同源性为98.66%。目的基因在大肠杆菌中以可溶形式高效表达。表达的重组蛋白占菌体可溶性总蛋白的57.5%,纯化的重组蛋白纯度达95.2%。重组蛋白可被兔抗微小隐孢子虫血清特异性识别,用重组蛋白免疫3次后,兔血清特异性抗体达到较高水平。表明,该重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 cp15/60基因 克隆 原核表达 抗原性
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小球隐孢子虫子孢子表面蛋白CP15/60基因的克隆和序列分析 被引量:3
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作者 何宏轩 张西臣 +5 位作者 欧阳红生 徐卫东 陈建宝 尹继刚 李建华 杨举 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第3期182-184,共3页
将小球隐孢子虫子孢子表面蛋白 (CP15 / 6 0 )编码区基因克隆及测序 ,并对其抗原决定簇进行分析。抽提牛源小球隐孢子虫孵囊基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增编码CP15 / 6 0的基因 ,然后将其克隆到pMD18_T载体中 ,用双脱氧链末端终... 将小球隐孢子虫子孢子表面蛋白 (CP15 / 6 0 )编码区基因克隆及测序 ,并对其抗原决定簇进行分析。抽提牛源小球隐孢子虫孵囊基因组DNA ,用聚合酶链反应 (PCR)扩增编码CP15 / 6 0的基因 ,然后将其克隆到pMD18_T载体中 ,用双脱氧链末端终止法测DNA序列。结果 ,用PCR扩增获得了CP15 / 6 0的编码区基因 ,并测定了该基因编码区序列。与GenBank比较 ,核苷酸序列同源性为 :98.9% ;推导的氨基酸序列同源性为 :99.3%。 展开更多
关键词 小球隐孢子虫 子孢子表面蛋白 cp15/60基因 序列分析 基因克隆 cp15/60基因
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微小隐孢子虫CP15/60基因在Hela细胞中的表达 被引量:2
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作者 何宏轩 张西臣 +3 位作者 欧阳红生 尹继刚 李建华 杨举 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2002年第5期266-268,共3页
目的 构建隐孢子虫CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,观察其在Hela细胞中的表达。方法用Xho I和EcoR I从pMD18-T-15/60中酶切得到CP 15/60基因,将其插入真核表达载体pCR3.1(+)的 XhoI和EcoRI位点,构建CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-... 目的 构建隐孢子虫CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,观察其在Hela细胞中的表达。方法用Xho I和EcoR I从pMD18-T-15/60中酶切得到CP 15/60基因,将其插入真核表达载体pCR3.1(+)的 XhoI和EcoRI位点,构建CP15/60真核表达载体pcDNA3.1-15/60,用脂质体介导法将其转染Hela细胞,并用G418加压筛选,用RT-PCR方法检测外源CP15/60基因的转录,ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果 酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pcDNA3.1-15/60,外源CP15/60基因能在转染细胞中有效转录,经检测表达产物具有良好的生物活性。结论 已成功地构建了pcDNA3.1-15/60真核表达载体,并在Hela细胞中具有良好的表达。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 cp15/60基因 HELA细胞 表达 真核表达载体
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微小隐孢子虫重组蛋白CP23与CP15/60-23免疫原性的研究 被引量:2
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作者 张珍 刘春会 +1 位作者 杜镇镇 王冬 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期24-26,共3页
目的探讨微小隐孢子虫重组蛋白CP23与CP15/60-23的免疫原性。方法用重组蛋白CP23与CP15/60-23分别免疫BALB/c小鼠,免疫3次,2w后检测抗CP23与CP15/60-23的特异性抗体IgG滴度、小鼠脾脏CD4+、CD8+T细胞及其培养上清中的细胞因子IFN-γ、IL... 目的探讨微小隐孢子虫重组蛋白CP23与CP15/60-23的免疫原性。方法用重组蛋白CP23与CP15/60-23分别免疫BALB/c小鼠,免疫3次,2w后检测抗CP23与CP15/60-23的特异性抗体IgG滴度、小鼠脾脏CD4+、CD8+T细胞及其培养上清中的细胞因子IFN-γ、IL-12,实验同时设PBS对照组;之后用微小隐孢子虫卵囊攻击免疫小鼠,收集小鼠粪便,计算小鼠排出的卵囊量。结果自免疫第2周特异性IgG抗体滴度水平逐渐升高,重组蛋白CP15/60-23组升高更为明显,免疫小鼠脾脏T细胞CD4+、CD8+百分比及CD4+/CD8+比值都增高,细胞因子IFN-γ、IL-12的水平亦增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05);卵囊攻击后,各组小鼠粪便中的卵囊数量都很低,各组之间无明显差异。结论重组蛋白CP23和CP15/60-23皆可产生较好的细胞及体液免疫反应,具有较强的免疫原性。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 重组蛋白cp23 重组蛋白cp15/60-23 免疫原性
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基于微小隐孢子虫重组CP15/60蛋白的间接ELISA检测方法的建立及上海市猪隐孢子虫感染情况调查 被引量:2
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作者 刘宇轩 米荣升 +5 位作者 黄燕 于慧珠 胡盼 詹婷婷 周金林 陈兆国 《中国动物传染病学报》 CAS 北大核心 2015年第4期37-43,共7页
为建立敏感、特异的猪隐孢子虫感染血清学检测方法,了解上海市猪隐孢子虫感染情况,以纯化的重组CP15/60(r CP15/60)为诊断抗原,建立了检测隐孢子虫感染的间接ELISA方法,并对上海市猪隐孢子虫感染情况进行血清学调查。结果显示,与Nested ... 为建立敏感、特异的猪隐孢子虫感染血清学检测方法,了解上海市猪隐孢子虫感染情况,以纯化的重组CP15/60(r CP15/60)为诊断抗原,建立了检测隐孢子虫感染的间接ELISA方法,并对上海市猪隐孢子虫感染情况进行血清学调查。结果显示,与Nested PCR方法检测结果相比,本研究建立的r CP15/60-ELISA方法的阴阳性符合率为83.3%,敏感性为100%,特异性为80%;重复性试验的变异系数在12.5%之内;对341份猪田间血清进行检测,阳性为194份,占56.89%,表明该方法可用于实验室初步诊断和现场猪隐孢子虫病的流行病学调查。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 重组cp15/60 间接ELISA 调查
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微小隐孢子虫重组BCG-CP15/60-23疫苗的构建及鉴定 被引量:1
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作者 李瑾 黄炳成 +9 位作者 魏庆宽 肖婷 崔勇 傅婷霞 江洪涛 胡颖新 文桂香 张佃波 韩广东 刘克义 《中国热带医学》 CAS 2008年第6期917-919,921,共4页
目的构建和鉴定微小隐孢子虫CP15/60-23基因重组卡介苗。方法以pET-30 a-CP15/60-23质粒为模板,PCR扩增CP15/60-23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP15/60-23基因片段用限制性内切酶切下定向克隆至大肠埃希菌-分枝... 目的构建和鉴定微小隐孢子虫CP15/60-23基因重组卡介苗。方法以pET-30 a-CP15/60-23质粒为模板,PCR扩增CP15/60-23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP15/60-23基因片段用限制性内切酶切下定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白(HSP)启动子下游,构建重组质粒pMV262-CP15/60-23,用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗(BCG-WT)构建微小隐孢子虫CP15/60-23基因重组卡介苗。结果扩增出792bp的微小隐孢子虫CP15/60-23基因片段,成功构建pMV262-CP15/60-23质粒,并通过PCR扩增和提取质粒、酶切等表明该质粒被正确导入BCG-WT中。结论成功构建微小隐孢子虫CP15/60-23基因重组卡介苗,为研究隐孢子虫病新的防治方法打下了基础。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 cp15/60—23基因 重组卡介苗 构建 鉴定
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小球隐孢子虫子孢子表面蛋白CP15/60原核表达载体的构建及表达
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作者 何宏轩 张西臣 +4 位作者 欧阳红生 李吉平 尹继刚 李建华 杨举 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2002年第6期416-418,共3页
用XhoI和EcoRI酶分别从pET_2 8a(+)和pMD18_T_15 /6 0质粒中酶切得到线性片段和CP15 /6 0基因片段 ,然后用T4DNA连接酶连接 ,构建重组的CP15 /6 0的原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,并用SDS_PAGE、ELISA和Westernlot进行鉴... 用XhoI和EcoRI酶分别从pET_2 8a(+)和pMD18_T_15 /6 0质粒中酶切得到线性片段和CP15 /6 0基因片段 ,然后用T4DNA连接酶连接 ,构建重组的CP15 /6 0的原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达 ,并用SDS_PAGE、ELISA和Westernlot进行鉴定。结果表明构建了CP15 /6 0的原核表达载体 ,得到了一分子量约为 16kDa的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 4 2 % 展开更多
关键词 子孢子表面蛋白cp15/60 原核表达载体 小球隐孢子虫 疫苗
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微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及抗血清的制备
9
作者 秦培兰 米荣升 +6 位作者 黄燕 周鹏 张国恩 苏庆美 呼高伟 曹薇 陈兆国 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2012年第7期54-59,共6页
以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)... 以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达载体,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明,获得了CP15-P23-CP15/60融合基因,并在大肠埃希菌中高效表达,Western blot显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清识别,制备的多克隆抗体能被重组蛋白特异性识别,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 cp15-P23-cp15/60融合基因 原核表达 重叠延伸PCR
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抗隐孢子虫鼠基因型CP15/60蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
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作者 李正锋 陈兆国 +1 位作者 何生虎 米荣升 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2010年第10期63-67,共5页
为获得高特异性的抗隐孢子虫单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),以原核表达的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)子孢子表面抗原CP15/60为免疫原,免疫Balb/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,用间接ELISA方... 为获得高特异性的抗隐孢子虫单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),以原核表达的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)子孢子表面抗原CP15/60为免疫原,免疫Balb/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,用间接ELISA方法进行抗体效价测定,有限稀释法进行亚克隆。以常规染色体分析法进行杂交瘤细胞的染色体分析,用McAb亚类鉴定试剂盒鉴定McAb亚型、间接ELISA法测定相对亲和力及交叉反应性、Western blot检测抗体的特异性。结果获得了2株能稳定分泌抗重组CP15/60(recombinant CP15/60,rCP15/60)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B4F7和D8H5,其腹水抗体效价均达到1∶107;染色体数目B4F7株为97条±4条、D8H5株为90条±7条,且观察到标志染色体;McAb亚型均为IgG1,轻链均为κ链;相对亲和力常数B4F7株为0.009μg/mL、D8H5株为0.016μg/mL;2种McAb均与rCP15/60蛋白发生特异性反应,与柔嫩艾美耳球虫卵囊可溶性蛋白、弓形虫裂殖子蛋白以及日本血吸虫虫体蛋白均无交叉反应,证实本试验获得了2株高特异性的抗隐孢子虫McAb。 展开更多
关键词 隐孢子虫 cp15/60蛋白 单克隆抗体
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Vaccination with pcDNA3-15/60 Naked DNA Encoding the Surface Protein of Sporozoites in Cryptosporidium parvum
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作者 HEHong-xuan ZHANGXi-chen YINJi-gang LIJian-hua YANGJu 《Agricultural Sciences in China》 CAS CSCD 2004年第8期634-640,共7页
The CP15/60 gene encoding the CP15/60 surface protein of sporozoites in Cryptosporidiumparvum was obtained by PCR so as to research the nucleic vaccine against C.parvum. Theeukaryotic expressing vector pcDNA3-15/60 wa... The CP15/60 gene encoding the CP15/60 surface protein of sporozoites in Cryptosporidiumparvum was obtained by PCR so as to research the nucleic vaccine against C.parvum. Theeukaryotic expressing vector pcDNA3-15/60 was constructed by inserting CP15/60 gene intopcDNA3 (+) in XhoⅠand EcoRⅠ. A vaccination protocol was the adult pregnant goatsinoculated intranasally with the pcDNA3-15/60 plasmid and their offspring were infectedwith C.parvum oocysts. The results showed that the pcDNA3-15/60 plasmid can induce theimmune response of goats and the vaccinated goats can transfer the immunity to offspringconferring protection against C.parvum infection. These suggested that the recombinantplasmid could be a DNA vaccine candidate. 展开更多
关键词 Cryptosporidium parvum (C.parvum) cp15/60 Nucleic acid vaccine Nasal immunization
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