含抗草甘膦 CP4-EPSPS 基因和耐逆 Trihelix 类转录因子GmGT-2 A基因的植物表达载体构建及转化验证

高效易用的植物表达载体在基因功能相关研究中起着重要的作用。以植物表达载体p BA002为基础载体,使用抗草甘膦CP4-EPSPS基因替换原载体的Bar筛选标记基因,获得新的植物表达载体p ES002。将大豆耐逆相关Trihelix类转录因子Gm GT-2A连接到p ES002,构建了同时含耐逆相关基因和抗除草剂标记基因的植物表达载体p ES002-Gm GT-2A。利用农杆菌介导的花序浸润法转化拟南芥,并对转基因植株进行抗草甘膦和耐盐性鉴定。结果表明,转基因植株在抗草甘膦和耐盐性上均显著强于对照,表明该载体可以用于转基因相关的基因功能研究。

Roundup Ready大豆中Lectin、CaMV 35S、NOS和CP4 EPSPS基因的提取与RT-PCR定性范围研究

[目的]研究Roundup Ready大豆的Lectin、CaMV35S、NOS和CP4EPSPS等被检测基因的RT-PCR定性范围。[方法]用CTAB法提取DNA,对Lectin、CaMV35S、NOS和CP4EPSPS等被检测基因的检测条件进行了优化,确定了被检测基因在相同RT-PCR条件下的定性范围。[结果]研究发现,不同被检测基因在相同RT-PCR条件下的浓度检出范围不同。Lectin为0.05～792mg/L,CaMV35S为0.25～792mg/L,NOS为0.25～396mg/L,CP4EPSPS为0.05～1980mg/L;共同的方法检出限LOD为5ng,体系浓度范围为0.25～396mg/L。[结论]确定了Roundup Ready大豆被检测基因的定性范围和检出限,可应用于大豆中相关基因的检测。

转基因大豆GTS 40-3-2产品加工过程中lectin和cp4 epsps成分降解规律研究进展

自转基因作物诞生以来,对其质疑之声从未间断。GTS 40-3-2是最早获批、应用最广泛的转基因大豆,为了更好地保护消费者知情权,国内外学者研究了不同大豆产品的加工工艺,探讨了转基因成分的变化规律,其关注点主要在转基因大豆种子检测方法的开发应用和食品(如豆浆、豆腐等)加工过程中外源成分分子量、含量的变化等方面,而关于食品加工过程中转基因成分的降解机理及本质的影响因素涉及较少。从物理、化学、生物作用3个方面对前人的研究进行梳理,分析转基因大豆GTS 40-3-2中 lectin 和 cp 4 epsps 基因降解的影响因素、降解规律,旨在找到减少甚至去除转基因成分的有效方式,为转基因大豆制品的检测和生产调控提供科学依据。

Bar+CP4EPSPS基因转化紫花苜蓿的研究及抗性鉴定

为了提高苜蓿抗除草剂的能力,以'公农1号'紫花苜蓿为试验材料,采用农杆菌介导的方法将Bar基因和CP4EPSPS基因转入紫花苜蓿中,研究了优化影响转化的5个主要因子(分别为外植体、农杆菌种类、侵染浓度、共培养时间、筛选浓度),建立了农杆菌介导的'公农1号'紫花苜蓿高效转化体系,获得转基因植株。结果表明:选择再生苗叶片作为外植体、EHA105农杆菌侵染、菌液浓度OD600值为0.8、共培养3 d、转化过程中草铵膦筛选浓度选择2 mg·L-1为宜,是最佳转化方案。试验结合分子检测和试纸条检测初步证明目的基因已经整合到紫花苜蓿中,最终喷施草甘膦确定12株为转基因植株。

子宫内膜癌患者血清HE4、CP2、HCgp-39含量与肿瘤恶性程度的关系探究

目的:探讨子宫内膜癌患者血清人附睾蛋白(HE4)、癌蛋白-2(CP2)、人软骨糖蛋白-39(HCgp-39)含量与肿瘤恶性程度的关系。方法:收集2012年5月~2015年8月本院收治的子宫内膜癌患者90例,根据病理分期分为早中期(Ⅰ~Ⅲ期)子宫内膜癌组59例、晚期(Ⅳ期)子宫内膜癌组31例,另取同期在本院接受刮宫治疗的子宫内膜增厚患者34例作为对照组。测定血清中HE4、CP2、HCgp-39及肿瘤标志物的含量以及肿瘤组织中增殖基因、侵袭基因mRNA表达量。结果:早中期子宫内膜癌组、晚期子宫内膜癌组患者血清中HE4、CP2、HCgp-39、糖类抗原125(CA125)、糖类抗原19-9(CA19-9)、癌胚抗原(CEA)的含量以及肿瘤组织中Bcl2、Chk1、PIK1、HER2、GDF-15的mRNA表达量均显著高于对照组,miRNA-199a-3p、Bax、caspase3、BRCA1、Kiss-1、KAI1的mRNA表达量低于对照组;晚期子宫内膜癌组患者血清中HE4、CP2、HCgp-39、CA125、CA19-9、CEA的含量以及肿瘤组织中Bcl2、Chk1、PIK1、HER2、GDF-15的mRNA表达量均显著高于早中期子宫内膜癌组,miRNA-199a-3p、Bax、caspase3、BRCA1、Kiss-1、KAI1的mRNA表达量低于早中期子宫内膜癌组;血清HE4、CP2、HCgp-39含量与CA125、CA19-9、CEA、Bcl2、Chk1、PIK1、HER2、GDF-15呈正相关,与miRNA-199a-3p、Bax、caspase3、BRCA1、Kiss-1、KAI1呈负相关。结论:子宫内膜癌患者血清HE4、CP2、HCgp-39含量可直接反映肿瘤恶性程度,有望成为肿瘤筛查及治疗指导的可靠手段。

转EPSPS基因大豆植株中蛋白的表达

采用ELISA定量测定法研究了转EPSPS基因大豆不同生长时期不同器官中CP4EPSPS蛋白含量的变化。结果表明：转EPSPS基因大豆不同器官在不同生育期CP4EPSPS蛋白含量表现出较大的差异，R8期籽粒中的CP4EPSPS蛋白含量在所有时期和所有组织中蛋白含量最高；上位叶和下位叶中CP4EPSPS蛋白除V3～V5期和R8期外的表达趋势一致，茎上部和茎下部中CP4EPSPS蛋白存不同时期表达动态趋势基本一致，根中CP4EPSPS蛋白含量在V3～V5期下降，然后逐渐升高，R1～R8期有一个大幅度的下降过程。从V1期至R8期，随着植株的不断生长，各组织中CP4EPSPS蛋白的含量有明显的变化。

四取代4-异丙苯基苯氧基酞菁铅复合凝胶玻璃的结构及光限幅性能研究

采用溶胶-凝胶(Sol-gel)湿化学工艺将四取代4-异丙苯基苯氧基酞菁铅PbPc(CP)4掺入二氧化硅(SiO2)凝胶玻璃基质,制备均匀掺杂的PbPc(CP)4复合凝胶玻璃,并通过紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱和透射电镜(TEM)图像对PbPc(CP)4在复合凝胶玻璃中的存在状态及结构进行了表征。对PbPc(CP)4在液相体系和固相体系中的光限幅性能分别进行了测试及对比研究。结果表明PbPc(CP)4以团簇形式存在于复合凝胶玻璃中,并由于钢性结构固相基质的保护作用使其在复合凝胶玻璃相对于液相体系中表现出较强的光限幅特性。

热处理对转基因秸秆中重组蛋白和重组DNA的降解作用

随着转基因作物种植面积的不断扩大,如何高效处理转基因秸秆成为了一个重要的科学问题。未经处理的转基因秸秆中的重组蛋白和重组DNA可以在土壤中存在很长时间,并对土壤生物多样性产生潜在负面影响。因此寻找一个既节约成本又对环境无害的秸秆处理方法非常重要。高温处理是降解转基因秸秆重组蛋白和重组DNA的有效手段,但目前对处理温度和处理时间的选择还缺乏系统的研究。本研究通过试纸条、聚合酶链反应(PCR)等方法检测不同温度和时间处理的转基因作物秸秆中重组蛋白和重组DNA的水平。结果表明,转基因大豆、棉花、玉米、水稻的秸秆在50℃处理3 h后,其体内的抗除草剂蛋白草胺膦乙酰转移酶(phosphinothricin acetyltransferase, PAT)等重组蛋白基本降解;但相同温度下,重组DNA的降解则需要4 d时间;提高处理温度可以在一定程度上缩短重组蛋白和重组DNA降解所需的时间。50℃处理4 d的条件在实际生产中通过堆肥就能实现。本研究从分子生物学的角度为转基因秸秆处理提供了依据。

转基因大豆非同源对照模板QC-PCR检测方法的建立

建立了转基因大豆CP4EPSPS基因的非同源对照模板QC-PCR检测方法。非同源竞争对照构建方法如下:利用CP4EPSPS基因特异引物,以大肠杆菌基因组DNA为异源模板,在低严谨度PCR扩增,回收适宜DNA片段并克隆到pMD-8载体上。该片段与CP4EPSPS基因相应序列除两端引物序列完全相同外,其他部分没有同源性。

α-氮化硅对硅磷酸钙生物陶瓷力学强度和生物活性的影响

理想的骨再生材料需要具有良好的生物活性和力学强度.前期的研究表明硅磷酸钙(Ca_(5)(PO_(4))_(2)SiO_(4),CPS)陶瓷具有良好的生物活性,可诱导骨髓基质干细胞的成骨分化,并在体内可促进新骨的形成.研究了α-氮化硅(α-Si_(3)N_(4))对CPS生物陶瓷显微结构、抗弯强度、体外磷灰石形成能力及细胞相容性的影响.结果表明:α-Si_(3)N_(4)的添加可在一定程度上提高CPS生物陶瓷的抗弯强度,当其质量分数为1.5%时,Si_(3)N_(4)-CPS陶瓷的抗弯强度为相同温度下纯CPS陶瓷的1.2倍.模拟体液浸泡实验表明:Si_(3)N_(4)-CPS生物陶瓷均具有良好的磷灰石形成能力.CCK-8细胞相容性实验结果表明:Si_(3)N_(4)-CPS生物陶瓷无明显细胞毒性,展示出良好的生物相容性.

硝化抑制剂对稻田土壤氧化亚氮排放及硝化作用的影响

【目的】为探究硝化抑制剂对土壤硝化作用及氧化亚氮(N_(2)O)排放的影响。选取稻田土为研究对象,采用微宇宙培养,研究尿素配施硝化抑制剂[3,4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)和2-氯-6-三氯甲基吡啶(CP)]对稻田土p H、无机氮、N_(2)O排放以及氨氧化微生物的影响。【方法】设置不加尿素和硝化抑制剂(ck)、单施尿素[氮(N)200 mg·kg^(1),U]、尿素+DMPP(添加量为氮量的1%,DMPP)和尿素+CP(添加量为氮量的2%,CP)4个处理。【结果】添加硝化抑制剂可以显著提高土壤p H(P<0.05)。与ck相比,施用尿素显著增加了土壤铵态氮(NH_(4)^(+)-N)质量分数(P<0.05),而两者之间硝态氮(NO_(3)^(-)-N)质量分数无显著差异。DMPP和CP处理的NO_(3)^(-)-N质量分数处于较低水平,且2个处理的净硝化速率都显著低于ck和U处理(P<0.05),有明显的硝化抑制效果。与ck相比,施用尿素显著提高了土壤N_(2)O排放(P<0.05),而配施硝化抑制剂显著降低了N_(2)O的累积排放(P<0.05)。与单施尿素相比,添加硝化抑制剂可有效降低氨氧化细菌(AOB)amo A基因拷贝数,而对氨氧化古菌(AOA)amo A丰度没有显著影响。相关性分析显示:N_(2)O排放量与土壤p H、AOB丰度和NO_(3)^(-)-N质量分数呈显著相关(P<0.05),说明土壤p H、AOB丰度和NO_(3)^(-)-N质量分数是影响土壤N_(2)O排放的关键因素。【结论】在中性稻田土中,AOB主导了土壤N_(2)O的排放和硝化作用,DMPP和CP可通过有效降低AOB丰度来抑制硝化作用和减少N_(2)O排放。

转基因大豆种植对根际土壤酶活性和养分的影响

采用盆栽试验,以耐草甘膦大豆M88、抗虫耐草甘膦大豆ZB及常规大豆中黄13为研究对象,比较分析转基因大豆对根际土壤酶活性和养分含量的影响。结果表明,在大豆成熟期时,与常规大豆中黄13相比,M88、ZB根际土壤碱性磷酸酶活性、过氧化氢酶活性、速效磷含量无显著差异,硝态氮含量显著下降。根际土壤脲酶活性、铵态氮含量则表现不同,其变化随大豆品种的不同而不同。相较于常规大豆中黄13,M88根际土壤脲酶活性和铵态氮含量无显著差异;ZB根际土壤脲酶活性显著下降,而铵态氮含量则显著上升。

转基因大豆中外源基因的二重PCR检测

用CTAB法提取转基因大豆(Roundup Ready品系)的总DNA.根据行业标准SN/T 1195-2003,合成用于扩增花椰菜花叶病毒(Cauliflowerm osaic viru,s CaMV)35S启动子的引物S1和S2、根癌农杆菌(Agrobacterium tum efaciens)CP4菌株EPSPS基因的引物Ea、ER和Eb.应用这5条(2组)引物对转基因大豆进行二重PCR检测时,扩增得到2个新片段,分别与片段S1ER、S1Eb大小一致.将片段S1ER、S1Eb进行克隆并测序,序列已在GenBank上登录,接受号分别为AY592954和AY596948.序列分析结果表明,片段S1ER含有CaMV 35S启动子和矮牵牛叶绿体转运肽序列(CTP)的部分序列,片段S1Eb含有CaMV 35S启动子部分序列、CTP和CP4 EPSPS基因的部分序列,原用于扩增CP4 EPSPS基因的引物中,仅引物Eb位于CP4 EPSPS基因中.重新合成扩增CP4 EPSPS基因的引物E1和E2,建立的二重PCR方法不仅适合于转基因RoundupReady大豆,还适合于其它植物中的CaMV 35S启动子和CP4 EPSPS基因的同时检测.

食用精炼大豆油DNA提取及单管巢式PCR检测

设计了针对转基因Roundup Ready大豆外源基因扩增的内外2对引物,分别位于CaMV35s启动子,CTP基因,CP4EPSPS基因区域,并成功对精炼大豆油中的外源基因进行单管巢式PCR检测。结果表明,用改良试剂盒法和冷冻干燥法提取大豆油中的DNA均可以满足单管巢式PCR检测要求;单管巢式PCR扩增对内外引物的Tm值有特殊要求,外引物的退火温度高于内引物。本实验建立的精炼大豆油转基因成分的单管巢式PCR检测方法特异性强,灵敏度高且快速方便。

促肾上腺皮质激素释放激素1型受体拮抗剂CP154,526潜在靶点预测研究

目的虚拟筛选促肾上腺皮质激素释放激素1型受体拮抗剂(CP154,526)的潜在作用靶点。方法本研究以CP154,526为研究对象,以PharmMapper服务器为工具,采用反向分子对接法筛选它的潜在靶点,并采用PyRx 0.8软件中Autodock vina进行正向分子对接验证。结果靶蛋白转甲状腺素蛋白(TTR)与CP154,526的打分排前,它们的药效团分子特征一致。CP154,526与TTR的核心氨基酸有相互作用。结论 TTR可能是CP154,526的作用靶蛋白之一。

聚乙烯载体催化剂的制备与表征

不同目数的聚乙烯粉末通过辐射方法接枝了4-乙烯基吡啶官能团.经甲基铝氧烷(MAO)预处理后负载了茂金属催化剂Cp2ZrCl2.光电子能谱和红外光谱结果表明催化剂通过MAO的作用负载在聚乙烯接枝4-乙烯基吡啶聚合物上.4-乙烯基吡啶的接枝含量、催化剂的负载率以及载体催化剂对乙烯单体的活性均随着聚乙烯粉末的颗粒减小而增大.

辐照对抗草甘膦转基因大豆DNA的降解研究

探索辐照对抗草甘膦(Roundup Ready,RR)转基因大豆DNA降解的影响,以达到合理应用转基因大豆的目的。分别以RR大豆籽粒、大豆粉为对象,采用剂量为0、4、10 kGy的Co 60γ-射线进行照射,监测辐照后样品DNA的质量浓度、分子量和外源cp4 epsps基因拷贝数等的变化情况。结果表明:随着辐照剂量的增加,RR大豆籽粒、大豆粉的基因组DNA完整性呈下降趋势,其中大豆粉的下降程度更高;RR大豆粉中cp4 epsps基因拷贝数随辐照剂量的升高而降低。然而,辐照剂量增加至10 kGy时,长片段lectin和cp4 epsps基因的扩增结果仍呈阳性。因此,辐照作为常用的食品处理手段,可以对RR大豆DNA造成降解,其中大豆粉DNA的降解程度高于完整的大豆籽粒,但要达到大幅降解RR大豆外源基因的目的,需与其他处理方式协同作用。

高致病性猪链球菌2型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立对高致病性猪链球菌2型毒力基因SalK、virB4-89K、cps2J同步检测的多重实时荧光定量PCR检测方法。方法根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域设计并合成3对引物及其探针;通过反应体系和扩增条件优化,建立快速鉴定高致病性猪链球菌2型的方法,并对方法的特异性、敏感性、重复性指标进行评估。结果反应体系具有良好的扩增效率,全部扩增检测可在60min内完成。SalK、virB4-89K、cps2J基因检测灵敏度分别为19cfu/ml、27cfu/ml和32cfu/ml。重复性试验中变异系数均小于3%。用该方法考核33株猪链球菌,包括1/2型、1型、3型至33型,以及9株常见对照菌株,仅猪链球菌1/2型检测到cps2J基因荧光信号增强。对疫情现场获得的SS2感染者血液进行检测,3个基因均阳性。结论建立的多重实时荧光定量PCR方法可快速检测高致病性猪链球菌2型,并能鉴定是否含有89K毒力岛基因SalK、virB4-89K,具有敏感、特异、重复性好的特点。

气流粉碎分级制备超细火炸药的实验研究

通过对“CP”系列气流粉碎分级机的改进，制备出了火炸药1-3-5-三氨基-2-4-6-三硝基苯(TATB)的亚微米级超细颗粒，并对超细火炸药粉体进行了粒度测试。