产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性双重荧光定量PCR方法的建立及应用

为了建立一种双重荧光定量PCR方法检测肠毒素cpe阳性的产气荚膜梭菌,试验通过对部分发表在NCBI中的产气荚膜梭菌序列进行比对,找到其α毒素和肠毒素cpe相对保守的序列,根据保守序列设计合成2对引物和1对探针,以构建的含有α毒素和cpe序列的克隆载体作为标准品,进行系列条件优化及特异性、灵敏性和重复性试验。结果表明:该方法具有很好的特异性和重复性,外毒素cpa的灵敏度为1.5×10^(-2)ng/m L,且在1.5×104~1.5×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.991;肠毒素cpe的灵敏度为1.8×10^(-2)ng/m L,且在1.8×103~1.8×10^(-2)ng/m L内Ct值与阳性质粒浓度的对数值呈很好的线性关系,R2值达到0.996;该方法对大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等细菌核苷酸无交叉反应;批间和批内重复性良好;同时对实验室保存的临床分离的疑似菌株用建立的荧光定量方法进行检测,结果临床分离菌株均为A型产气荚膜梭菌。说明该双重荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性强和重复性好。

牛产气荚膜梭菌分离株毒素基因的检测与分析

为了解黑龙江省牛源产气荚膜梭菌分离株的基因型,检测β2和CPE两种次要毒素因子在牛源产气荚膜梭菌分离株中的携带情况。通过PCR方法检测了产气荚膜梭菌13个野毒株的cpa、cpb、etx、itx四种分型毒素、cpb2、cpb2的两个等位基因突变体(atypical cpb2和consensus cpb2)及肠毒素(cpe)基因。结果表明:92.3%(12/13)的产气荚膜梭菌分离株为A型,检测到1株D型;A型菌中β2毒素基因检出率为66.7%(8/12);β2毒素基因阳性菌株中75%(6/8)携带非典型cpb2基因,50%(4/8)携带典型cpb2基因,非典型突变体占优势。动物致病性试验发现β2毒素阳性菌株(8株)与β2毒素基因阴性菌株(4株)各有2株分离株具有致病性。所有菌株CPE毒素基因PCR检测均为阴性。研究为产气荚膜梭菌病的发病机理和疫苗开发提供了理论依据。

A型产气荚膜梭菌KdpD/E双组份系统调节毒素基因表达的研究

目的 明确kdpD基因编码的蛋白结构特点,探究A型产气荚膜梭菌中KdpD/E系统与alpha和cpe毒素基因表达趋势的关联性。方法 用试剂盒法提取A型Cp菌的基因组DNA,PCR扩增kdpD基因并测序,对该基因测序结果进行分析及蛋白结构预测;分别提取A型产气荚膜梭菌培养2-9 h 8个时间段的总RNA,采用电泳和核酸蛋白检测仪,测定各个时间段总RNA的浓度和纯度;将RNA反转录为cDNA,用实时荧光定量PCR检测kdpD、kdpE双组份系统与alpha、cpe毒素编码基因的相对表达量。结果 生物信息学预测KdpD蛋白结构中α-螺旋占76.1%,β-折叠占23.1%,β-转角占0.855%,无规则卷曲占0.427%,无跨膜区;提取总RNA的质量较高,其A_(260)/A_(280)值在1.8~2.1之间;实时荧光定量PCR检测kdpD、kdpE、alpha、cpe基因扩增产物溶解曲线单一,同时kdpD/E基因与alpha和cpe毒素基因表达趋势相似,即随着细菌的生长,信号基因和毒素基因的表达量均增加,且在3 h和4 h增幅明显,并在4 h时表达量最高,随后逐渐降低,其中alpha毒素基因表达量的变化更为明显。结论 产气荚膜梭菌kdpE基因的蛋白结构预测符合其作为应答调节蛋白的结构功能,A型Cp菌中KdpD/E双组份信号系统与alpha和cpe毒素基因的表达存在一定的相关性,alpha毒素作为A型产气荚膜梭菌产生的主要毒素与KdpD/E系统的相关性更显著。