CDV、CPV和CPIV多重PCR检测方法的建立

为了建立一种快速诊断犬瘟热病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒的多重PCR方法,参照GenBank中的犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬副流感病毒(CPIV)基因序列,设计了3对引物分别用于特异扩增犬瘟热病毒F基因、犬细小病毒VP2基因和犬副流感病毒F基因上的目的片段。通过优化反应条件,建立同时扩增CDV(740bp)、CPV(419bp)和CPIV(559bp)的多重PCR方法。结果表明特异性和敏感性良好,对CDV、CPV、CPIV 3种病毒的最低核酸检测量为1ng/μL。临床样品的多重PCR检测结果表明,建立的多重PCR方法能够对CDV、CPV、CPIV单个感染或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。

基于CPⅣ网轨道三维检测系统的改进设计

轨道几何形位对于列车运行安全极为重要。基于CPⅢ轨道几何形位静态检测时需对全站仪设站跟踪传统轨检小车上的棱镜,作业烦琐且会产生一定的测量误差。通过利用改进的轨检小车上安装全站仪捕捉CPⅣ基准网点棱镜进行轨道几何形位静态检测,并利用欧拉角与刚体一般运动规律对该系统进行数学建模,可较快算出轨道被检测点以及中线坐标,提高测量精度以及效率。

犬副流感病毒的分离鉴定及部分基因序列分析

目的分离并鉴定犬副流感病毒（canine parainfluenza virus,CPIV）,并对该病毒N、HN和F基因进行序列分析,研究其遗传变异情况;为CPIV诊断、治疗以及预防奠定分子生物学基础。方法用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺组织,盲传3代,观察病变情况,收集72 h培养液进行PCR鉴定、血凝特性以及形态学观察。同时,用3对特异性引物,扩增N、HN和F全基因,进行序列测定和分析,并制作系统进化树。结果从犬肺中成功分离出一株犬副流感病毒,并命名为QF20100726。该病毒能凝集豚鼠、猪、鸡和人O型血,电镜观察病毒呈圆形、长丝状等形态多样、大小不等的颗粒状;序列分析表明,与人源、犬源等10株有代表性的副流感病毒基因相比,N基因核苷酸同源性为95.7%~99.8%,氨基酸同源性为97.4%~99.6%,其中有两处氨基酸发生新的变异,分别是第257位由V变成了A,第301位由A变成了T;HN基因核苷酸同源性为95.5~99.8%,氨基酸同源性为96.3~99.6%,F基因核苷酸同源性为94.7%~99.6%,氨基酸同源性为95.6%~99.3%。有两处发生特异变异,分别是56位由T变成了S,89位由T变成了M。结论成功分离犬副流感病毒QF20100726分离株,其血凝特性及超微形态特征均符合CPIV特性,N、HN和F全基因生物进化树显示,该分离株与犬副流感病毒分离株08-1990（登录号：KC237063）亲缘关系最近;N基因氨基酸在第257位（由V变成了A）和第301位（由A变成了T）,F基因氨基酸在第56位（由T变成了S）和89位（由T变成了M）发生了特异性变异。这些数据将为CPIV的防控奠定基础。

1株犬副流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

试验旨在分离鉴定犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV),并对其生物学特性进行研究。用Vero细胞接种感染CPIV阳性犬肺脏组织,盲传4代,收集72 h病毒液进行RT-PCR鉴定、电镜观察、血凝试验、热敏性试验、紫外照射试验及病毒一步生长曲线的测定,同时扩增N基因进行序列分析,并构建系统进化树。结果显示,试验成功从出现咳嗽、流鼻涕等呼吸系统疾病症状的病犬肺脏中分离出1株CPIV,命名为CPIV-BJ01;RT-PCR扩增结果发现,在534 bp处有特异性目的条带。病毒电镜观察发现,其超微结构呈圆形、有囊膜、直径在80～200 nm之间;血凝试验显示,病毒在4和37℃均能凝集1%猪红细胞,与报道的CPIV血凝特性一致;病毒对热敏感,长时间高温下病毒毒价会随之下降;紫外照射可使病毒在短时间内对细胞的感染性急剧下降。病毒一步生长曲线测定结果显示,在12～48 h病毒高速增殖,细胞培养液中病毒滴度急剧上升,之后趋于稳定。CPIV N基因序列与19株有代表性的副流感病毒N基因相比,其核苷酸序列同源性为97.1%～99.8%。遗传进化分析表明,CPIV-BJ01与PIV5 1168-1(登录号:KC237064.1)和PIV5 ZJQ 221(登录号:KX100034.1)位于同一分支上,亲缘关系较近。

应用CPⅣ网进行轨道几何状态测量方法研究

研究目的:高速铁路轨道精调前应进行轨道几何状态测量。现行的方法是采用CPⅢ后方交会自由设站进行轨道几何状态测量,再与设计参数进行比较,之后通过精调使轨道的平顺性各项参数满足设计要求。利用轨道基准网相邻点具有较高相对精度和点位永久保存可用于运营维护阶段的特点,本文提出在轨道基准网(CPIV)点上利用强制对中装置设站、后视,配合轨检仪进行轨道几何状态静态检测的新方法,结合工程实际对该方法进行现场试验。研究结论:(1)采用CPIV强制对中设站方法进行板式无砟轨道几何状态静态检测,设站时间短,作业效率显著提高;(2)CPIV强制对中设站方法利用相邻点间的高精度可确保轨道的高平顺性,经现场试验证明,测量成果正确可靠,满足规范要求;(3)应用CPⅣ网进行轨道几何状态测量,统一了轨道板、轨道精调控制基准,平顺性指标较好,值得推广应用;(4)研究成果可应用于高速铁路板式无砟轨道施工和运营维护阶段轨道几何状态静态检测,对相关测量规范的编制和完善具有参考价值。

山羊副流感病毒3型JS2013分离株对豚鼠致病性的研究

为了探究CPIV3 JS2013分离株的致病性,本试验采用豚鼠研究该病毒在动物体内的复制及机体组织病理损伤等情况。结果表明,攻毒后2 d攻毒组的豚鼠开始出现临床症状。RT-PCR检测攻毒后第3-7天出现病毒血症,攻毒后第3-14天均可以从肺组织中检测到病毒。剖检观察攻毒组豚鼠,豚鼠肺出现实变、淤血、肿大,病理组织学检测发现攻毒组豚鼠肺组织出现肺泡间隔增宽、肺泡融合、炎性细胞浸润等变化。HI试验表明豚鼠感染后第5天开始出现血凝抑制抗体,之后持续升高至21 d仍保持较高的水平。

犬多价高免血清的研制及应用

目的:研制犬多价高免血清用于犬病毒性传染病的紧急预防和治疗。方法:选择1岁以上临床检查健康的昆明狼种犬及部分土犬20条,用犬瘟热病毒(CDV)、犬细小病毒(CPV)、犬传染性肝炎病毒(ICHV)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)弱毒和强毒多次交叉免疫,颈动脉无菌采血,分离血清,实验室采用微量中和试验、血凝抑制试验来检测抗体效价。结果:应用本制品高免血清在临床上取得了较好的效果。结论:研制成稳定、高效的犬多价高免血清,并获得了较好的经济效益和社会效益。

核酸水平检测犬副流感病毒方法的建立

根据GenBank中与犬副流感(CPIV)同源性较近的SV5病毒N基因保守序列,利用DNAStar软件设计了一对特异性引物,能扩增265bp大小的片段,并以此建立了检测CPIV的RT-PCR方法,实验证明该对引物特异扩增CPIV;不扩增犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的四种病原的核酸。检测临床病料20份,其中2分为CPIV阳性。此法敏感性较高。是检测犬急性传染性呼吸道疾病(CIRD)中CPIV的有效的方法。

山羊副流感病毒3型人工感染山羊的致病性

为了明确新分离的山羊副流感病毒3型（CPIV3）JS2013株的致病性，本试验采用动物感染试验的方式研究该病毒在本属动物体内的复制、排毒以及组织病理损伤等情况。通过病毒血症、临床症状、病理组织学检测、HI抗体及中和抗体检测综合分析病毒对山羊的致病性。结果表明，攻毒后的山羊出现以喷嚏、咳嗽、流鼻涕、眼分泌物增多以及呼吸困难为主的临床症状；攻毒后1d即可检出病毒血症，持续到攻毒后7d，且从攻毒后1～7d可以从鼻拭子中检测到排毒。剖检观察攻毒组山羊肺组织出现增生实变、肿大，组织病理学检测发现肺组织出现肺泡间隔增宽、肺泡结构消失、炎性细胞浸润等变化。HI和中和试验表明，山羊感染后7d开始出现血凝抑制抗体，14d出现中和抗体，并持续升高至28d。以上结果证实CPIV3JS2013株对山羊具有较强的致病性，为后续研究奠定基础。