猪POU1F1基因第三内含子Msp Ⅰ酶切片段多态特征的研究

采用PCR-RFLPs技术,以Msp I为内切酶,检测猪POU1F1基因中片段为2.1 kb的第三内含子中的多态位点:1.68 kb(C等位基因)和0.85/0.83 kb(D等位基因),分析各多态位点在长白猪、杜洛克猪、小梅山猪、香猪、姜曲海猪5个品种群中的分布,并通过X2检验比较这5个猪种间的基因型差异。X2适合性检验结果表明:Msp I酶切突变位点的3种基因型在5个品种中分布差异均极显著(P<0.01)。中国地方品种小梅山猪、姜曲海猪等位基因C的比例很高,中国地方品种香猪等位基因C的比例则比较高,国外品种长白猪、杜洛克猪等位基因C的比例很低。

基于生物信息学分析人类线粒体转录终止因子1基因启动子

目的线粒体转录终止因子1(mitchondrial transcription termination factor 1,MTERF1)编码蛋白质是调控线粒体基因表达和氧化磷酸化的重要因子。文中旨在分析人类MTERF1基因的转录调控序列、转录因子及其结合位点。方法采用进化足迹法,利用生物信息学在线软件对人类MTERF1基因5'端上游的启动子分布、Cp G岛、转录因子及其结合位点进行分析。结果人类MTERF1基因定位于7q21.2,基因全长7845 bp,含有4个外显子和3个内含子。基因上游5'端2500bp的核苷酸序列至少存在2个启动子,其中1878-2447 bp之间可能包含核心启动子。启动子区序列中存在1个长为812 bp的Cp G岛。人类和小鼠MTERF1同源基因存在26个共同的转录因子结合位点。结论生物信息学在线软件能预测人类MTERF1基因启动子和转录因子结合位点,提高了针对该基因启动子的研究效率。

Lnc CPS1-IT1靶向调控内皮-间质转化抑制OSA所致肺动脉高压的机制

目的探讨在低氧环境下,长链非编码RNA CPS1内含子转录本1(Lnc CPS1-IT1)通过影响内皮-间质转化(EndoMT)治疗阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)所致肺动脉高压(PH)的分子调控机制。方法本研究为实验研究。以人脐静脉内皮细胞构建OSA的细胞模型,并使用该模型分别构建空白对照组,空过表达载体组(阴性对照过表达载体),长链非编码RNA CPS1内含子转录本1(Lnc CPS1-IT1)过表达组(Lnc CPS1-IT1过表达载体),空沉默载体组(阴性对照沉默载体),沉默Lnc CPS1-IT1组(沉默Lnc CPS1-IT1的短发夹RNA);使用吡咯烷二硫代甲酸铵(PDTC)阻断细胞核因子κB(NF-κB)信号通路构建Lnc CPS1-IT1过表达+PDTC组。比较空过表达载体组与Lnc CPS1-IT1过表达组,空沉默载体组与沉默Lnc CPS1-IT1组EndoMT相关分子标志物[血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、锌指转录因子(SNAIL)]和胶原蛋白(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原)mRNA、蛋白表达,以及促炎细胞因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-10、IL-13]的水平。通过Transwell测定法检测Lnc CPS1-IT1对于细胞迁移能力的影响。RNA免疫沉淀和荧光素酶报告基因法检测Lnc CPS1-IT1和缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的结合情况。比较PDTC处理前后EndoMT相关分子标志物和胶原蛋白mRNA、蛋白表达,以及促炎细胞因子的水平。结果Lnc CPS1-IT1过表达组CD31 mRNA和蛋白表达均较空过表达载体组升高,α-SMA、SNAIL、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达均较空过表达载体组降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)。沉默Lnc CPS1-IT1组中CD31 mRNA和蛋白表达均较空沉默载体组降低,α-SMA、SNAIL、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达均较空沉默载体组升高,差异均有统计学意义(均P<0.001)。Lnc CPS1-IT1过表达组TNF-α、IL-10、IL-13的水平均较空白过表达载体组降低,沉默Lnc CPS1-IT1组TNF-α、IL-10、IL-13的水平均较空白沉默载体组升高,差异均有统计学意义(均P<0.001)。与空白对照组(49.33±2.52)相比,Lnc CPS1-IT1过表达组细胞迁移数量减少(30.00±2.65),而沉默Lnc CPS1-IT1组细胞迁移数量增多(82.00±4.00),差异均有统计学意义(均P<0.001)。RNA免疫沉淀结果显示,Lnc CPS1-IT1与HIF-1α的结合较免疫球蛋白G增加,差异有统计学意义[(4.22±0.03)比(0.99±0.02),t=163.50,P<0.001]。荧光素酶报告基因法检测结果显示,Lnc CPS1-IT1与HIF-1α结合后的荧光强度下降[(120.33±2.83)比(24.33±2.12)],差异有统计学意义(t=43.42,P<0.001)。Lnc CPS1-IT1过表达+PDTC组CD31 mRNA和蛋白质较Lnc CPS1-IT1过表达组升高,α-SMA、SNAIL、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白质均较Lnc CPS1-IT1过表达组降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)。Lnc CPS1-IT1过表达+PDTC组TNF-α、IL-10、IL-13水平均较Lnc CPS1-IT1过表达组下降(均P<0.05)。结论Lnc CPS1-IT1可以通过抑制HIF-1α的转录活性影响NF-κB通路,降低炎症因子的释放,靶向调控EndoMT,从而抑制OSA所致PH。

lncRNA GABPB1-IT1靶向下调miR-501抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制

目的:探讨lncRNA GABPB1-IT1靶向下调miR-501抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制。方法:qRT-PCR方法检测宫颈癌HeLa、Caski、SiHa细胞和正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞中GABPB1-IT1表达水平。宫颈癌SiHa细胞分成Control组、Vector组(转染pcDNA)、GABPB1-IT1组(转染pcDNA-GABPB1-IT1)、GABPB1-IT1+miR-NC组(转染pcDNA-GABPB1-IT1和mimics control)、GABPB1-IT1+miR-501组(转染pcDNA-GABPB1-IT1和miR-501 mimics)。CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭;Western blotting检测细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin蛋白表达。利用starbase数据库对GABPB1-IT1的靶基因进行分析,通过荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。结果:宫颈癌HeLa、Caski、SiHa细胞中GABPB1-IT1表达水平低于正常宫颈上皮Ect1/E6E7细胞(均P<0.05)。宫颈癌HeLa、Caski细胞中GABPB1-IT1表达水平高于宫颈癌SiHa细胞(均P<0.05)。与Control组、Vector组比较,GABPB1-IT1组宫颈癌SiHa细胞存活率降低,细胞迁移和侵袭数目减少,细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平降低,E-cadherin蛋白表达水平升高(均P<0.05)。与GABPB1-IT1+miR-NC组比较,GABPB1-IT1+miR-501组宫颈癌SiHa细胞中miR-501水平升高,细胞存活率、细胞迁移数目和侵袭数目均升高,细胞中MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白表达水平升高,E-cadherin蛋白表达水平降低(均P<0.05)。GABPB1-IT1靶向下调miR-501表达水平。结论:lncRNA GABPB1-IT1靶向下调miR-501抑制宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移。

GK-IT1抑制JAK信号通路对胃癌细胞增殖和侵袭迁移的影响

目的研究长链非编码RNA GK内含子转录本1(GK-IT1)通过Janus激酶(JAK)信号通路对胃癌细胞生物学活性的影响。方法UALCAN平台分析胃癌组织中GK-IT1的表达。通过实时定量PCR(qPCR)评估GK-IT1在人胃癌细胞中的表达。BSG-823细胞进行GK-IT1干扰片段si-GK-IT转染或si-GK-IT转染与JAK2信号通路激活剂Coumermycin A1两者联合处理,分为阴性对照组、si-GK-IT1组和si-GK-IT1+JAK2组。通过CCK-8、划痕和Transwell实验评估细胞增殖、迁移和侵袭情况。qPCR或Western blot检测B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CCP3)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)的表达。结果GK-IT1在胃癌组织中表达上调,且与肿瘤分期和分级有关(P<0.05)。与胃黏膜上皮细胞RGM-1相比,胃癌细胞中GK-IT1表达水平更高(P<0.05)。与阴性对照组相比,si-GK-IT1组细胞增殖、迁移和侵袭能力减弱;si-GK-IT1+JAK2组逆转了上述结果(P<0.05)。与阴性对照组相比,si-GK-IT1组Bcl-2、MMP-9和p-JAK2的表达降低,而CCP3的表达升高(P<0.05);与si-GK-IT1组相比,除CCP3表达降低外,si-GK-IT1+JAK2组的其余因子表达增加(P<0.05)。结论GK-IT1通过JAK信号通路抑制来调控胃癌细胞的增殖和迁移侵袭过程,有望成为胃癌的潜在靶点。

SPRY4-IT1在子痫前期患者胎盘中的表达及对滋养层细胞增殖、侵袭的影响

目的探讨SPRY4内含子转录本1(SPRY4-IT1)在子痫前期(PE)患者胎盘中的表达及对滋养层细胞增殖、侵袭的影响。方法选取2017年6月至2019年6月在宜宾市第二人民医院产科行剖宫产术的34例PE患者(PE组)和32例正常妊娠孕妇(对照组)作为研究对象。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测胎盘中SPRY4-IT1表达水平。将HTR8/SVneo细胞分为空白对照组(不转染)、无义转染组(转染空载体)和上调组(转染SPRY4-IT1过表达载体);检测各组HTR8/SVneo细胞增殖、周期分布、细胞凋亡、侵袭情况及细胞中基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达情况。结果PE组胎盘组织中SPRY4-IT1表达水平较对照组显著下调(P<0.05);上调组HTR8/SVneo细胞OD值,S期、G_(2)/M期HTR8/SVneo细胞比例、穿膜细胞数,MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均较无义转染组、空白对照组显著升高(P<0.05),HTR8/SVneo细胞凋亡率、G_(0)/G_(1)期HTR8/SVneo细胞比例均较无义转染组、空白对照组显著降低(P<0.05)。结论SPRY4-IT1在PE患者胎盘组织中呈低表达,SPRY4-IT1可能通过上调MMP-2、MMP-9表达,调控细胞周期,参与促进HTR8/SVneo细胞增殖、侵袭及抑制其凋亡过程。

知母皂苷A-Ⅲ调控ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴在非小细胞肺癌中的作用机制研究

目的:研究知母皂苷A-Ⅲ(timosaponin A-Ⅲ,TAⅢ)对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)生长的影响及其作用机制。方法:采用不同浓度TAⅢ(5、10、15、20、25、30μmol/L)处理非小细胞肺癌细胞A549,使用CCK8法检测细胞活力。以定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测二磷酸腺苷核糖化因子鸟苷酸激酶1-内含子转录因子1(adenosine diphosphate ribosylation factor guanylate kinase 1-intronic transcript 1,ASAP1-IT1)、Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1,YAP1)在组织及细胞中的表达。以EDU、流式细胞术和Western blot检测ASAP1-IT1、DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β(DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta,DNMT3b)、YAP1对细胞增殖情况、细胞凋亡率及其相关基因(Bax和caspase-3)与抗凋亡基因Bcl2的影响。亚硫酸氢盐测序聚合酶链式反应(Bisulfite sequencing PCR,BSP)分析检测ASAP1-IT1与YAP1的关系。RNA免疫沉淀法(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)和qRT-PCR法检测ASAP1-IT1与DNMT3b之间的相互作用。免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测DNMT3b与YAP1之间的关系。采用qRT-PCR方法检测TAⅢ对ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴相关基因表达的影响。结果:ASAP1-IT1和YAP1在NSCLC组织和A549细胞中表达上调,而DNMT3b表达下调,加入TAⅢ可逆转这些效应。沉默ASAP1-IT1和YAP1、过表达DNMT3b或应用TAⅢ可增加A549细胞凋亡率和细胞凋亡相关指数。TAⅢ有逆转沉默或过表达ASAP1-IT1、DNMT3b和YAP1的作用。最后发现ASAP1-IT1与DNMT3b相互作用,而DNMT3b与YAP1相互作用。结论:ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴通过调节细胞增殖和凋亡促进NSCLC进展。TAⅢ通过调节ASAP1-IT1/DNMT3b/YAP1轴抑制肺癌细胞增殖,促进其凋亡。

长链非编码RNA FGF14-IT1在人胃癌组织和细胞中的表达及临床意义

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)成纤维细胞因子14内含子转录本1(FGF14-IT1)在人胃癌组织和细胞中的表达及临床意义。方法收集83例胃癌患者的肿瘤组织和配对的癌旁组织,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测组织、4种胃癌细胞株及正常胃黏膜细胞中FGF14-IT1的表达水平;采用χ2检验分析其表达水平与患者临床病理特征的相关性;同时采用单因素和多因素logistic回归分析FGF14-IT1的表达水平与胃癌转移的关系。结果胃癌组织中FGF14-IT1的相对表达量为1.630±1.896,明显低于癌旁组织的表达量(2.257±2.599),差异有统计学意义(t=2.108,P<0.05)。与正常胃黏膜细胞GES-1表达量比较,胃癌细胞株AGS、MGC-803、SGC-7901中FGF14-IT1表达量明显降低(P<0.05),但BGC-823胃癌细胞株中的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。FGF14-IT1表达量与患者浸润深度、淋巴结转移、TNM分期相关(P分别为0.028、0.039、0.048)。单因素分析发现,胃癌转移与FGF14-IT1、肿瘤大小、分化程度、浸润深度相关(P分别为0.001、0.041、0.041、<0.001)。多因素分析发现胃癌转移与FGF14-IT1、浸润深度相关(P分别为0.023、0.021)。结论lncRNA FGF14-IT1与胃癌变化转移相关,可能是潜在的胃癌治疗和预后评估分子标志物。

PJ综合征疾病基因STK11/LKB1转录调控的生物信息学分析

目的 初步了解STK11/LKB1的转录起始位点信息 ,分析其可能的候选启动子区段 ,为以后进行STK11/LKB1的转录调控研究作准备。方法 通过检索网上数据库资料 ,获得STK11/LKB1的转录本信息 ;运用MethPrimer和FirstEF两种程序 ,对包含STK11/LKB1基因“第一外显子”、“第一内含子”及其 5’UTR区上游的gDNA片段序列 ,分别进行CpG岛分析和第一外显子预测 ;利用PromoterInspector等预测程序 ,对STK11/LKB1的启动子进行预测。结果 目前已知的STK11/LKB1转录本中 ,5’UTR区最长的序列为BC0 0 7981(GenBank登录号 ) ;STK11/LKB1基因属于典型的CpG岛相关基因 ,现有的“第一外显子”之 5’上游已不再有外显子 ,已有的 5’UTR区基本已基本接近STK11/LKB1的转录起始位点 ;在BC0 0 7981的 5’上游约 2 0 0bp到 40 0bp内很可能存在有启动子。结论 STK11/LKB1已有的 5’UTR区基本已基本接近STK11/LKB1的转录起始位点 ,在BC0 0 7981的 5’上游数百bp内很可能能找到具有启动活性的区段从而有利于进行下一步的转录调控研究。实验明确其真实的转录起始位点应已相对容易。