浙江省9株猪链球菌2型分离株Cps2J全基因克隆与序列分析

目的了解浙江猪链球菌2型(SS2)分离株的分子基础及与国内外其他分离株的基因差异程度,确定Cps2J基因变异位点和频率,为该地区的猪链球菌防治提供科学依据。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后采用ABI自动测序仪测定序列,并同国内外其他分离株的基因进行比较。结果扩增出9株菌株的Cps2J基因的完整开放阅读框(ORF)都为999bp,编码333个氨基酸,9株菌株Cps2J片段核苷酸高度同源,同源性在99.7%～100%;与国内外其他的SS2核苷酸的同源性为98.8%～99.0%,与猪链球菌1型的同源性只有56.8%～57.0%。结论9株浙江省猪链球菌2型分离株Cps2J基因序列非常保守,这些不同来源的菌株可能有相同的起源。

3株人源猪链球菌2型湖南株cps2J、gdh、ef基因进化分析

目的对3株人源猪链球菌2型(S.suis 2)湖南株(HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102)cps2J、gdh、ef基因进行序列测定和进化分析,了解其变异和进化状况,为人感染S.suis疫情的防控提供数据。方法设计S.suis 2 cps2J、gdh、ef基因PCR引物,对HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株进行PCR扩增和序列测定,测序结果利用Lasergene和Mega5软件进行分析。结果 cps2J、gdh、ef基因包含的完整开放阅读框(ORF)分别为999bp、1 347bp、2 532bp,分别编码333、448、843个氨基酸。在线BLAST同源性分析表明,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株属于S.suis 2,3菌株cps2J、gdh、ef基因组序列之间的核苷酸同源性均为100%;进化树显示,HNCS201001、HNCS201101、HNCS201102株与国内外猪源和人源S.suis 2菌株属于同一分支,同源性比较显示3株S.suis 2湖南分离株cps2J、gdh、ef基因与其他国内外S.suis株核苷酸序列同源性分别为99.8%～100%、96.4%～100%和99.7%～100%,氨基酸同源性分别为98.5%～100%、98.7%～100%和99.5%～100%。结论 3株人源S.suis 2湖南株cps2J、gdh、ef基因序列与国内外S.suis 2菌株相应基因序列同源性高,变异程度小。

猪源2型链球菌福建株cps2j基因PCR检测及序列分析

设计并合成一对扩增2型猪链球菌cps基因的特异性引物,以猪2型链球菌福建株(SS2PFJ07)DNA为模板,筛选最佳反应条件,建立检测cps2j基因的PCR方法,并对PCR扩增产物进行序列测定和同源性比较分析。结果如下:应用该方法对猪2型链球菌福建株和标准阳性株进行扩增,均获得与预期大小一致的675bp特异性目的片段,而对8株非2型猪链球菌的扩增结果均呈阴性;敏感性测定最低可检出100cfu细菌量或50pg细菌DNA;SS2PFJ07cps2j基因部分核苷酸及其推导的氨基酸序列与猪链球菌2型不同菌株的同源性分别达98.7%～100%和97.8%～100%。上述结果表明建立并优化的猪2型链球菌cps2j基因的PCR检测方法敏感性好、特异性高,能用于2型猪链球菌的分子流行病学调查和快速检测;序列分析表明猪2型链球菌福建株与国内外8株标准株之间同源性高、亲缘关系密切。

2型猪链球菌河南株cps2J基因的遗传进化关系分析

从河南某猪场断奶仔猪发生疫情的病死猪脑脊液中分离到一株细菌,经革兰氏染色初步确定为猪链球菌,应用PCR方法扩增猪链球菌谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,gdh)和荚膜多糖基因(capsular polysaccharide,cps)进行猪链球菌及血清型鉴定,将阳性产物测序,并进行序列比较分析。结果表明,该分离株为2型猪链球菌,与参考菌株同源性在98%以上,其cps2J基因与人源致病性猪链球菌同源性达99.6%。

猪链球菌2型荚膜多糖cps2J基因的克隆与原核表达

利用PCR方法从猪链球菌2型(SS2)四川资阳分离株449-1扩增出cps2J基因,克隆到pMD18-T载体,经酶切与表达质粒pMAL-p2x构建重组表达质粒pMALp2x-cps2J,转化至宿主菌TB1中诱导表达。SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组菌株表达出了约80ku的可溶性目的蛋白MBP-cps2J,约占菌体蛋白总量的13.5%。表达蛋白用Amylose树脂层析柱纯化,将纯化的融合蛋白MBP-cps2J免疫家兔制备抗血清,经ELISA和协同凝集试验检测,其与SS2呈特异性阳性反应。

猪链球菌2型广西GX01株Cps2J基因克隆与序列分析

将分离到的广西猪链球菌2型，用针对猪链球菌2型Cps2J序列的引物Cps1／Cps2进行扩增，得到与预期相符的675bp的片段，将PCR产物回收连接转化后测序，得到了675bp的核苷酸序列，经同源性分析表明，GX01株Cps2J序列与猪链球菌2型国内外的毒株核苷酸同源性在98．7％～100％之间，具有高度的同源性；与猪链球1型的同源性只有66．7％。

一种食源性溶血链球菌cps2J毒力基因特异性PCR检测方法的建立

根据GenBank上已发表链球菌cps2J毒力基因序列设计合成了一对可扩增长度为1 152 bp目的片段的引物,成功建立了特异性PCR方法用于食源性溶血链球菌毒力基因cps2J的检测。该方法的特异性和灵敏性试验结果显示,对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、绿脓杆菌、粪肠杆菌、变形杆菌以及藤黄微球菌的PCR检测结果均呈阴性,对分离的9株食源性溶血链球菌菌株进行了检测,电泳结果均呈阳性;检测目的菌株DNA的最低敏感度可达3.2×10^(-1)ng/m L。结果表明,此法特异性强,灵敏性高,能准确地检测肉制品中携带毒力基因cps2J的溶血链球菌,可作为食源性溶血链球菌快速诊断和流行病学调查的手段。

应用多重荧光Real-time PCR快速鉴定猪链球菌2型

目的建立能同时鉴定链球菌2型(S.suis2)和确定主要毒力标志MRP的快速检测方法。方法根据S.suis2CPS2J与MRP的保守序列,设计并合成了2对引物及其相应探针。通过优化各反应物的浓度、配比和循环程序,建立能从组织中直接检测CPS2J和MRP的实时荧光PCR方法。结果能在3h内对送检组织样品检测确定S.suis2型和MRP毒力基因,最低检测菌体浓度24CFU/ml。与普通PCR相比,敏感性在检测CPS2J时比普通PCR高至少10倍以上,而在检测MRP时比其高100倍。与葡萄球菌、化脓链球菌、沙门氏菌、S.suis1型、9型等无交叉反应。同一人在试剂放置0d、20d和60d检测,以及不同人用同一方法检测,变异系数均小于5%,差异不显著。用于检测SSsc0501攻毒后的样品,结果在心、肝、脾、肺、肾、淋巴结、脑中均检测到S.suis2阳性,MRP阳性。而在肌肉中,S.suis2和MRP均为阴性。结论建立的多重荧光Real-timePCR敏感性高、特异性强,稳定性和重复性好,能用于可疑S.suis2型组织样品的快速定型和毒力鉴定。

环介导等温扩增技术结合横向流动试纸条检测猪链球菌2型的应用研究

目的建立一种猪链球菌2型的快速检测方法。方法以猪链球菌2型cps2J基因序列为检测靶标设计6条环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,其中2条促环引物分别标记异硫氰酸荧光素(FITC)和地高辛(Dig),用横向流动试纸条(LFD)检测扩增产物,建立猪链球菌2型LAMP-LFD检测方法。结果所建立的检测方法能够特异性的检测出猪链球菌2型,与试验对照菌株不存在交叉反应,其最低检测限为76cfu/mL,在对100份样品的检测中,LAMP-LFD方法检测出14份阳性样品,培养法检测出12份阳性样品,LAMP-LFD方法检测阳性率略高于病原培养法,两者间的P>0.05无统计学差异。结论所建立LAMP-LFD检测方法具有特异性好、敏感性高、操作简单、快速等特点,适合于动物食品中猪链球菌2型的检测。

三重PCR方法检测猪链球菌2型

根据发表文献,设计合成三对引物,建立三重PCR方法,分别扩增猪链球菌2型cps2J、epf,mrp基因,目标片断大小分别为:230bp、570bp、860bp。对三重PCR方法进行特异性、敏感性、重复性试验,结果显示该三重PCR方法特异性好,敏感性高,重复性好,能快速的检测猪链球菌2型。

四川猪2型链球菌病的PCR检测

2005年7月中下旬,四川资阳等地人、猪陆续发生一种发病急、死亡快、高度散发的疾病。从病死猪组织中分离出19株链球菌,设计合成3对引物,分别对分离菌株进行了猪链球菌16SrRNA、CPS2J、MRP基因片段扩增,有15株菌3个基因的扩增结果均为阳性,表明此次疫情的病原为猪2型链球菌。

双重实时荧光PCR快速检测猪链球菌2型方法的建立及应用

根据GenBank上公布的MRP与CPS2J的开放性阅读框保守序列,运用BEACON Desigener 2.0软件设计和合成了2对引物和其相应的荧光探针,优化各个反应物的浓度和实时荧光PCR循环程序,建立从组织中直接检测2型链球菌主要毒力因子MRP与CPS2J的实时荧光PCR方法。双重实时荧光PCR检测2型猪链球菌方法能够从病料中直接检测2型猪链球菌并可以检测出该菌的主要毒力基因MRP,运用该方法可以最低检测到24CFU/mL 2型猪链球菌,并且与其他血清型链球菌和其他病原菌无交叉反应,特异性良好。通过对8个样品在3个不同时间的检测,结果显示该方法的稳定性和重复性均很好。

猪链球菌2型PCR-ELISA检测方法的建立与优化

根据已发表的猪链球菌2型的cps2j基因序列,设计合成上游标记生物素的1对引物和1条标记地高辛的特异性探针,建立了该菌的PCR-ELISA检测方法。方法利用PCR仪作为杂交场所,并对几个主要条件参数进行优化,结果显示在鲑鱼精DNA浓度1.6mg·mL-1、变性温度为94℃、变性时间为1min、探针浓度为0.5umol·mL-1、杂交温度55℃、杂交时间1min、一抗作用时间45min、二抗作用时间40min时检测方法敏感性最好,特异性最强。通过对17个阴性样本检测,测得平均值为0.057,方差为0.047,计算得临界值为0.198。

猪链球菌广东株的分离鉴定及药敏试验

对来自广东韶关某猪场的疑似猪链球菌病病料进行分离鉴定,共分离到3株链球菌,对这3株链球菌进行了形态学观察、生化试验、16 S rRNA基因序列分析、猪链球菌2型的毒力基因检测及药敏试验。结果表明,其形态、染色、生化特性均符合猪链球茵的特点,测序后Blast同源性分析,证实3株菌株均为猪链球菌,用猪链球菌2型Cps2J引物进行PCR扩增,获得预期的459bp大小的目的片段。药敏试验结果表明,该菌对3种常用抗生素表现出敏感,对21种常用抗生素表现出耐药。

猪链球菌2型三重PCR检测方法的建立

针对猪链球菌2型gdh、mrp及cps2J基因设计3对引物,建立了该菌的三重PCR方法。30μL反应体系中3组引物gdh1、gdh2,mrp1、mrp2及cps2J1c、ps2J2的最适浓度比为1∶1∶1.67。最佳反应条件为94℃3 min;94℃1 min,55℃40 s,72℃50 s,30个循环;72℃5 min。可扩增到目的基因gdh、mrp及cps2J的片段大小分别为689、532和457 bp;猪链球菌2型BHI培养物的检测下限为450 CFU;猪肉人工污染样品经4 h增菌,其检测下限仅为4 500 CFU。以上结果显示,该三重PCR方法可用于组织样品和纯培养物中猪链球菌2型的检测,具有快速、特异和简便的特点。

高致病性猪链球菌2型多重实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立对高致病性猪链球菌2型毒力基因SalK、virB4-89K、cps2J同步检测的多重实时荧光定量PCR检测方法。方法根据SalK、virB4-89K、cps2J基因保守区域设计并合成3对引物及其探针;通过反应体系和扩增条件优化,建立快速鉴定高致病性猪链球菌2型的方法,并对方法的特异性、敏感性、重复性指标进行评估。结果反应体系具有良好的扩增效率,全部扩增检测可在60min内完成。SalK、virB4-89K、cps2J基因检测灵敏度分别为19cfu/ml、27cfu/ml和32cfu/ml。重复性试验中变异系数均小于3%。用该方法考核33株猪链球菌,包括1/2型、1型、3型至33型,以及9株常见对照菌株,仅猪链球菌1/2型检测到cps2J基因荧光信号增强。对疫情现场获得的SS2感染者血液进行检测,3个基因均阳性。结论建立的多重实时荧光定量PCR方法可快速检测高致病性猪链球菌2型,并能鉴定是否含有89K毒力岛基因SalK、virB4-89K,具有敏感、特异、重复性好的特点。

琼脂糖凝胶电泳与核酸印迹杂交法检测细菌毒力基因PCR产物的灵敏度比较研究

目的探讨核酸印迹杂交法在检测细菌毒力基因方面的应用价值。方法分别以10倍连续稀释的O157∶H7肠出血性大肠埃希菌和血清2型猪链球菌染色体提取物为模板,与志贺毒素2基因(stx2)和荚膜多糖2J基因(cps2J)特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR)。用1%琼脂糖凝胶电泳及核酸印迹杂交法检测PCR产物,比较两种方法的最低检测限。结果 1%琼脂糖凝胶电泳对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.7×102cfu(56.87 pg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为4.3×102 cfu(12.65 pg)/PCR体系;核酸印迹杂交法对EDL933菌株stx2基因PCR产物的最低检测限为6.7×10-1 cfu(56.87 fg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的最低检测限为4.3×10-1 cfu(12.65 fg)/PCR体系。结论用核酸印迹杂交法检测肠出血性大肠埃希菌stx2基因和猪链球菌cps2J基因PCR产物的灵敏度均比普通琼脂糖凝胶电泳检测法高了1000倍。

猪链球菌2型浙江嘉兴株毒力基因序列分析

目的猪链球菌2型(SS2)浙江嘉兴ZJJX2008分离株毒力基因序列测定与分析。方法提取菌株DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增菌株Cps2J和EF基因全片段,克隆入质粒载体,纯化后测定序列,并与国内外其他分离株基因进行比较。结果 Cps2J、EF基因完整开放阅读框(ORF)分别为999,2532bp,各自编码333,843个氨基酸,ZJJX2008分离株Cps2J、EF基因与国内外SS2菌株核苷酸同源性分别为99.1%～100%和99.8%～99.9%,氨基酸同源性分别为99.2%～99.7%和99.3%～99.5%;ZJJX2008分离株Cps2J基因与猪链球菌1型荷兰分离株6555核苷酸和氨基酸同源性只有66.7%和51.8%。结论 ZJJX2008分离株为猪链球菌2型菌株,Cps2J、EF基因与国内外其他SS2分离株比较序列非常保守,变异不大。