中国国内首次检测到犬细小病毒CPV-2c

目的分析犬细小病毒(CPV)流行毒株的分子生物学特征,研究犬细小病毒遗传进化规律,了解CPV流行毒株现状。方法收集CPV阳性犬粪PCR扩增CPV-2c后进行RFLP分析,并进行病毒结构蛋白VP2基因的克隆、测序并进行序列分析。结果经RFLP分析及序列测定,2份样品均为CPV-2c阳性,序列分析显示CPV-06/09及CPV-07/09VP2序列与国外CPV-2c的基因序列同源性在99%以上。进化分析表明CPV-06/09及CPV-07/09在进化树中形成一个独立的分支,不同国家的CPV-2c存在一定的差异。结论通过RFLP分析及测序证实2份犬粪便样品为CPV-2c阳性,首次在我国检测到CPV-2c。系统进化树显示两分离株CPV-2c与国外CPV-2c有所差异,可能是传入我国的CPV-2c在向适应地区条件的方向进化,也可能是我国已有CPV变异。

犬细小病毒临床分离株VP2基因进化分析

为了对犬细小病毒临床分离株的VP2基因进行遗传变异分析,了解本地区犬细小病毒流行的优势型别及病毒变异情况。采集2例患犬细小病毒病的动物粪便,提取病毒基因组,设计特异性引物,PCR扩增VP2基因,对扩增产物测序,对序列结果与同属其他毒株VP2基因序列用MEGA 7和MegAlign进行同源性分析和遗传进化分析。同时比较其氨基酸变异情况。结果显示,PCR扩增出VP2基因,测序结果显示大小为1755 bp,2株病毒VP2基因NCBI序列登录号分别为MH155192和MH155193,MH155192与MF467233.1和JQ743891.1的核苷酸同源性为99.9%,MH155193与KY937651.1、KP260509.1、KY937641.1核苷酸同源性为99.8%。MH155192主要位点氨基酸分别为为267Y,324I,370Q,426D,440A。MH155193主要位点氨基酸分别为267Y,324I,370R,426E,440T。且2株病毒297位均为A。表明分离到的2株病毒分别为新CPV-2b和CPV-2c型。

兔抗犬细小病毒2a型多克隆抗体交叉保护研究

为探究犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)血清型只有一种的条件下,常用疫苗CPV-2型和CPV-2a病毒免疫血清抗体对国内流行CPV-2a病毒的中和率,试验将藏獒源CPV-2a毒株(105 TCID50/100μL)和CPV-2(104.5 TCID50/100μL)疫苗接于F81细胞增殖,PEG6000法浓缩制成免疫原,各免疫新西兰长白兔3只,间隔2周1次,共免疫4次。收集血清纯化制备多克隆抗体,通过血凝抑制试验(HI)和血清中和试验(SN)分别用2种抗体中和CPV-2、CPV-2a病毒,对两者保护率进行初步评价,并对本地感染CPV-2a的4只犬,每组2只进行治疗,每日跟踪白细胞消长规律。结果显示,CPV-2a多抗中和国内流行病毒CPV-2a的HI抗体、中和抗体水平都极显著高于CPV-2多抗(P<0.01),而中和CPV-2病毒的HI抗体、中和抗体水平两者差异不显著(P>0.05),CPV-2a多抗组治疗能较快恢复正常值,2组白细胞数有显著差异(P<0.05)。结果表明,CPV-2a多抗与常用CPV-2型疫苗免疫抗体相比能高滴度的中和CPV-2a,更适用于中国犬细小病毒的防制,对研发新型生物制品有一定意义。

犬细小病毒VP2基因的扩增、序列分析及其原核表达

为了制备犬细小病毒（CPV）VP2蛋白抗原，试验采用PCR方法，以一例疑似CPV感染的出血性肠炎患犬粪便为样品对VP2基因进行扩增，并将该目的基因克隆到pMD18-T质粒上。进行EcoRI／HindⅢ双酶切鉴定及测序鉴定；对该基因进行序列分析后将VP2基因克隆到原核表达载体pET-32a上，并转化E．coliBL21（DE3），诱导表达后进行Ni-NTA亲和层析纯化、Western—blot试验验证其生物活性。结果表明：克隆的基因全长为1790bp；该基因序列与已报道的CPV基因序列同源性高达99．2％～99．9％，氨基酸同源性达99．0％～99．8％，为新CPV-2a基因亚型，其中与泰国株GQ379042．1亲缘性最高，仅1个碱基不同，与猫细小病毒同源性高达98．69％；获得了87ku的目的蛋白。说明该临床病例确为CPV感染。该株细小病毒VP2蛋白的成功表达可为吉林省CPV流行病学调查提供资料，可用于进一步的疫苗研究及免疫学方法的建立。

犬细小病毒BJ5株分离和VP2序列分析

从北京地区疑似犬细小病毒感染的病死犬血样粪便中分离1株犬细小病毒并进行VP2基因扩增和序列分析,命名为CPV-BJ5株。应用CrFK细胞分离病毒,经2次传代后出现稳定的血凝特性(HA);免疫荧光试验表明,感染分离毒的细胞与抗CPV单克隆抗体反应并出现特异性的胞浆荧光;试验犬接种分离病毒后14d内均表现为体温升高、食欲减退、腹泻及血便等典型发病症状;序列测定结果表明分离病毒的VP2基因与CPV-15、CPV-020、CPV-NJ、CPV-HLJ-JQ株的核苷酸相似性分别为99.2%、99.5%、99.1%、99.9%,氨基酸相似性分别为99.5%、100%、100%、99.3%;与CPV-Northern、CPV-39株的VP2基因核苷酸相似性为98.9%、98.1%,氨基酸相似性为98.8%、99.5%。表明该分离病毒与CPV-15、CPV-020、CPV-NJ、CPV-HLJ-JQ株在基因型上同属于CPV-2a毒株。

南宁地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为了解广西南宁地区犬细小病毒(CPV)的流行现状与病毒变异情况,本试验对初步确诊为犬细小病毒病的12份阳性病料提取基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增VP2基因序列并测序,将12个阳性毒株样本VP2基因测序结果与GenBank中登录的17株国内外CPV分离株VP2基因进行同源性比对,采用Mega 7.0软件绘制遗传进化树,分析其病毒亚型和遗传进化情况。结果显示,成功扩增得到12个毒株样本的VP2基因片段,大小约1 755bp,12株阳性样本毒株的VP2基因同源性在99.2%～100.0%之间,其中NN01与NN07、NN02与NN06同源性最高,为100.0%;阳性样本毒株与国内其他分离株VP2基因的同源性为97.6%～100.0%,其中NN08、NN10及NN04与CPV-ZJ1579同源性最高,均为100.0%,属于CPV-2a亚型;阳性样本毒株与国外代表性毒株同源性在98.1%～99.8%之间。遗传进化树分析表明,12个样本毒株中有3株属于CPV-2a亚型,3株属于CPV-2b亚型,6株属于CPV-2c亚型。这是继2018年初广西分离到CPV-2c型CPV后,首次发现南宁地区大规模流行CPV-2c亚型病毒,预示着CPV-2c亚型CPV在国内的流行正在增加。综上所述,广西南宁地区CPV-2a、CPV-2b与CPV-2c亚型并存,但CPV-2c亚型的比重比其他地区大,这也给该地区提供了新的防治信息,在实际CPV防控工作中除了对CPV-2a、CPV-2b等传统流行亚型的关注之外,更应该重视CPV-2c亚型CPV的防控。

犬细小病毒西宁分离株的分子鉴定及VP2基因序列分析

本研究首次对地处青藏高原地区的西宁的犬细小病毒分离株(命名为CPV-XN1)进行了VP2基因的克隆、测序,并与我国以及我国周边国家地区的流行株,以及参考株进行了核苷酸同源性比对和进化分析。VP2基因分子鉴定结果显示,该分离株为CPV-2b亚型株,VP2基因核苷酸序列全长1755bp,蛋白长度为584个氨基酸,分子量大小约为64.58 k Da,VP2蛋白为稳定蛋白,总体亲水性较高,可溶于水,VP2蛋白的二级结构以无规则卷曲为主;VP2基因的T-B细胞共同表位为序列的97-105位点,其序列为ALDDTHAQI,位点286-294,序列为GLPPFLNSL。西宁分离株与我国各地区流行株的核苷酸序列同源性和氨基酸同源性均在99%以上;CPV-XN1分离株VP2基因氨基酸序列中的非同义突变位点有1处,在78位氨基酸处;VP2基因进化树分析发现:CPV-XN1分离株与CPV-2b北京分离株(KT162024)和CPV-2b兰州分离株(JQ268284)组成一个微小分支,并与其它CPV-2b分离株处于同一个大支上,从进化角度上鉴定此研究分离株应属CPV-2b株。因此,本实验对青海西宁CPV-XN1分离株的VP2基因抗原表位分析和系统进化的探讨结果,有望为我国CPV分子流行病学调查提供一定的数据参考依据。

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒(canine parovirus,CPV)VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPVVP2基因插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 755bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0mmol/L IPTG、诱导5h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。

水貂肠炎病毒、猫泛白细胞减少症病毒以及犬细小病毒2型间的关系比较

水貂肠炎病毒(MEV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、犬细小病毒2型(CPV-2)为隶属于细小病毒属的三种极为相似的自主复制型病毒。最初人们主要根据水貂、猫、犬患病症状相似的特点,注意到它们间可能的密切关系。时至今日,已对这3种病毒的许多方面进行了分析研究。

犬细小病毒YBYJ株NS1基因的克隆及序列分析

为了克隆YBYJ株犬细小病毒（CPV）NS1基因，并对其进行序列分析，试验选择GenBank中的CPV—NS1基因（登录号为NC_001539）序列设计1对特异性引物，以延边大学预防兽医学实验室分离的CPVYBYJ株为毒株，经PCR扩增得到NS1基因，将其克隆至pMD18-Tsimple载体，然后进行基因测序和序列分析。结果表明：YBYJ株CPV—NS1基因大小为2007bp，编码668个氨基酸，与国内外其他10株CPV—NS1基因的核苷酸同源性为98．0％-99．7％，氨基酸同源性为96．7％-99．7％。提示CPV—NS1基因变异较小，遗传进化相对稳定。

肠炎型犬细小病毒的分离鉴定及病毒滴度测定

为获得肠炎型犬细小病毒分离株,采集犬细小病毒胶体金初检阳性的3份粪便,采用同步接毒法分别接种猫肾细胞(F81)和犬肾细胞(MDCK)进行分离培养,F81盲传至第2代出现细胞病变,MDCK盲传至第3代出现细胞病变,2种细胞均仅从病料3中分离出1株病毒。采用PCR方法鉴定该分离株为犬细小病毒并命名为CPV3。根据VP2基因核苷酸序列绘制的系统进化树及其推导氨基酸序列的分析,确定CPV3属于CPV-2a亚型。测定CPV3在MDCK中72 h时的组织细胞半数感染量(TCID50),第5代次(CPV-M-5)和第10代次(CPV-M-10)的TCID50数值分别为10-4. 83/0. 1 mL和10-5. 50/0. 1 mL,这为后续测定重组犬干扰素活性试验提供了材料。

犬细小病毒单克隆抗体研究进展

犬细小病毒２型（ＣＰＶ２）是引起犬急性出血性胃肠炎和幼犬急性心肌炎的病原，主要危害幼犬，特别是２～６月龄小犬。该病发病急，病程短，死亡率高，传染性强，危害严重。自Ｅｕｇｓｔｅｒ（１９７７）［１］在美国报道以来，世界各国均有发生和流行［２］。梁士哲等...

不同熔解曲线分析技术在犬细小病毒基因分型中的比较

本试验旨在建立基于聚合酶链式反应(PCR)技术的犬细小病毒2型(CPV-2)2种不同熔解曲线技术基因分型方法,并通过比较其熔解温度差异(△Tm)评价不同方法对犬细小病毒单核苷酸多态性(SNP)位点的分型鉴别能力。结果显示,探针熔解曲线聚合酶链式反应(FMCA-PCR)方法中不同SNP位点之间熔解温度差异(△Tm)均大于3℃,而在高分辨率熔解曲线聚合酶链式反应(HRM-PCR)方法中熔解温度差异(△Tm)只有0.2~0.6℃。临床30份CPV-2核酸样本基因分型结果显示,FMCA-PCR方法的准确率为100%;而HRM-PCR方法准确率为96.6%(未形成杂合子前)。虽然HRM-PCR方法中不同SNP位点之间熔解温度差异较小,影响其基因分型结果,但通过杂合子HRM分析后可提高该方法的准确率。本试验结果表明,基于PCR方法的2种不同熔解曲线基因分型技术均具有较好的SNP位点分型鉴别能力,为熔解曲线基因分型技术在兽医临床中的应用提供实际参考依据。

2014—2015年黑龙江省牡丹江地区犬细小病毒2型分子流行病学调查

为了调查黑龙江省牡丹江地区犬细小病毒(CPV-2)流行情况,利用基于CPV-2部分VP2基因(568 bp)PCR的方法,对2014年5月—2015年4月收集的40份腹泻犬粪便拭子进行了检测与分析。结果显示,在40份样品中,20份样品为CPV-2阳性(50%),其中,新CPV-2a(Ser297Ala)型和CPV-2c型分为别占75%(15/20)和25%(5/20);序列分析结果显示,20个CPV-2毒株VP2基因的核苷酸和氨基酸的相似性分别为98.6%~100%和98.2%~100%;进化树分析表明,与其他国家CPV-2参考毒株相比,鉴定的新CPV-2a型毒株和CPV-2c型毒株与中国CPV-2参考毒株形成一个进化群(A),其中鉴定的新CPV-2a型毒株分布于不同的分支中。结果提示,CPV-2在牡丹江地区犬腹泻病例中呈现高感染率。

犬细小病毒兰州分离株VP2基因的克隆及进化树分析

本研究首次对地处西北地区的兰州的犬细小病毒分离株(命名为CPV/LZ-kbz11)进行了VP2基因克隆、测序,并与参考株、我国各地区流行株以及周边国家流行株进行了进化树分析和核苷酸同源性比较。结果显示,该毒株能在犬肾细胞系(MDCK)上成功生长,但不引起细胞病变。该分离株为CPV-2b亚型毒株,与M19296(CPV-2亚型参考毒株)、EU659118(CPV-2a亚型参考毒株)、EU145954(CPV-2b亚型参考毒株)、AB054224(CPV-2c亚型参考毒株)的核苷酸序列同源性分别为99.0%、99.3%、99.2%、99.2%;与我国及周边主要流行毒株EU213079(CPV-2a,浙江)、EF666059(CPV-2a,北京)、EF599096(CPV-2a,韩国)、EF592511(CPV-2a,台湾)、EU483512(CPV-2b,浙江)、FJ222821(CPV-2c,意大利)的核苷酸同源性分别为99.6%、99.5%、99.4%、99.4%、99.4%、99.4%。对VP2基因中非同义置换的氨基酸分析结果显示,兰州分离株与对比毒株的非同义突变位点共有4处,分别在第267位、324位、426位和440位的氨基酸处。

犬细小病毒2a型致弱疫苗株的培育与免疫效力试验

为了获得犬细小病毒(CPV)变异株的致弱疫苗株,将CPV-2a野毒株(YZ10-5)在FK81细胞上连续传代,评价不同代次毒种对易感幼犬的毒力。用高代次传代毒种免疫高母源抗体(MDA)幼犬,经CPV-2a和CPV-2b强毒攻毒,评价致弱株的免疫保护效力。结果表明,CPV-2a毒株(YZ10-5株)在FK81细胞上连续传至31代,毒力明显减弱,传至61代无明显毒力。用61代致弱毒种(YZ10-5/F61),2×10^3TCID50/剂,间隔3周,2次皮下注射接种高母源抗体幼犬,第2次免疫后3周用CPV-2a和2b变异株口鼻攻毒,所有免疫犬无明显临床症状,且粪便无排毒,而未免疫犬全部发病和粪便排毒。初步研究表明, CPV-2a传代致弱毒株(YZ10-5/F61)有希望用于开发CPV防控的新型疫苗。

犬细小病毒CPV-JL19株分离鉴定及遗传进化分析

为探究吉林地区犬细小病毒(CPV)的生物学特性及当前CPV流行株的遗传变异,采集吉林省长春市某动物医院疑似感染CPV病犬的肛拭子,经PCR鉴定为CPV阳性。利用F81细胞进行病毒培养,通过电镜形态学观察、血清学、分子生物学及攻毒试验等方法进行验证。结果表明,成功分离鉴定出1株CPV,命名为CPV-JL19株;电镜下病毒粒子形态符合CPV形态特征;血凝试验证实该分离毒株具有血凝性。全基因组测序分析表明,该病毒基因组全长4727bp,GenBank登录号:MN519258,基因型为CPV-2c。该毒株与蒙古(5MGL)、四川(SC/23/2017)和上海(CPV-SH1516)等地的分离株亲缘关系较近,核苷酸同源性均为99.9%。动物回归试验表明,感染的比格犬具有呕吐、排稀便、体质量减轻等典型的临床症状。本试验分离出1株CPV强毒株,通过比较该毒株的遗传变异及其流行特性,为CPV的疾病治疗及疫苗研究提供参考。

敲低内源性PERK基因对犬细小病毒复制的影响

利用新型CRISPR interference(CRISPRi)技术进行蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)目的基因PERK的敲低。首先,利用慢病毒包装系统经嘌呤霉素筛选后构建稳定表达dCas9-KRAB蛋白的MDCK细胞株。然后,设计靶向PERK转录起始位点(transcription start site, TSS)的特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),向该稳转细胞株转染表达sgRNA的质粒,通过qPCR检测PERK的mRNA表达水平;同时,内质网应激激活剂衣霉素(tunicamycin, Tu)处理该细胞后,通过qPCR检测PERK通路下游GRP78、GRP94、ATF4、GADD34和CHOP等基因mRNA的表达水平。最后,将犬细小病毒2型(canine parvovirus type 2,CPV-2)接种于PERK敲低的MDCK细胞株,通过绝对定量PCR测定不同时间点CPV-2的复制水平。结果表明,敲低PERK基因表达后,CPV-2的复制水平显著下降,说明PERK参与调控CPV-2的复制。以上结果为进一步探究内质网未折叠蛋白反应(endoplasmic reticulum unfolded protein response, UPR^(ER))对CPV-2复制的影响及病毒与宿主相互作用的分子机制研究奠定了基础。