质粒载体pUC19在头孢哌酮抗性基因(CPZ^r)克隆中的应用探讨

目的 :研究质粒pUC19是否为头孢哌酮抗性基因 (CPZr)分子克隆的理想载体。方法 :氯化钙法将质粒pUC19转化至工程菌E .coliDH5获得pUC19转化菌 ;采用试管二倍液体稀释法进行pUC19转化菌对 2 5种抗生素的敏感性测定 ;鸟枪法克隆耐药质粒pFC片段到载体pUC19获得含有CPZr 的重组质粒。结果 :pUC19转化菌对氨苄青霉素高度耐药 (MIC >2 5 6 μg/ml) ,对第一代头孢菌素中度耐药 ,对第二代头孢菌素中的头孢孟多耐药 ,而对头孢呋新敏感 ,在第三代头孢菌素中只对头孢哌酮耐药 (MIC ,6 4μg/ml) ,对其他第三代头孢菌素及 β 内酰胺酶抑制剂均高度敏感 ,同时敏感性测定结果还发现pUC19转化菌对氟喹诺酮类和氨基糖甙类抗性素均敏感。pUC19作为载体克隆到含有头孢哌酮抗性基因 (CPZr)的重组质粒少 ,克隆效率低 ,未能达到预期的目标。结论 :pUC19不适合作为CPZr 的克隆载体。

大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位

用鸟枪法从耐药质粒ｐＦＣ上克隆到头孢哌酮抗性基因。快速小规模制备质粒ＤＮＡ进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株，经多次传代，克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒ｐＦＣ物理图谱比较，定位出头孢哌酮抗性基因在ｐＦＣ物理图谱上３２ｋｂ至４８ｋｂ区间内，其分子量约１６ｋｂ。该基因包含有ＥｃｏＲⅠ、ＳｍａⅠ、及ＰｖｕⅡ位点。