微小隐孢子虫子孢子表面蛋白CP15/60编码基因核酸疫苗的研究

将编码CP15 / 6 0的基因插入真核表达载体pcDNA3(+)中构建重组质粒pcDNA3 15 / 6 0 ,然后经鼻粘膜免疫怀孕成年山羊 ,观察其免疫应答的产生情况及其对后代的保护力。结果为抗CP15 / 6 0抗体存在于免疫山羊的血浆和初乳中。pcDNA3 15 / 6 0经鼻粘膜免疫的怀孕山羊产生的免疫力能传给子代 ,使子代对微小隐孢子虫 (Cryp tosporidiumparvum)感染产生保护。CP15 / 6 0 DNA免疫母羊的后代比非免疫母羊的后代排出卵囊少且排卵时间短。这就表明重组质粒pcDNA3 15 / 6

应用间接ELISA检测微小隐孢子虫抗体的研究

以在大肠埃希氏菌中表达的微小隐孢子虫 (Cryptosporidum parvum )子孢子表面抗原CP15为抗原 ,以辣根过氧化物酶 (HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗 ,建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA。试验筛选出的最佳反应条件为 :大肠埃希氏菌CP15抗原包被量为 1μg/孔 ,用10 0mL/L的兔血清进行封闭 ,以正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。试验结果表明 ,应用CP15重组蛋白作为诊断微小隐孢子虫抗体的抗原具有特异性高。

检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA方法的建立

以在 E.coli高效表达的微小隐孢子虫子孢子表面抗原 CP15 /6 0为抗原 ,以辣根过氧化物酶 (HRP)标记的山羊抗鼠 Ig G为二抗 ,建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接 EL ISA方法。经检测筛选出最佳反应条件为 1μg/孔纯化的E.coli表达的 CP15 /6 0抗原包被酶标板 ,用 10 %的兔血清进行封闭 ,以正常 E.coli裂解上清液稀释待检血清。结果表明应用 CP15 /6 0重组蛋白作为诊断 C.parvum抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。

微小隐孢子虫CP15抗原基因原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建微小隐孢子虫子孢子表面抗原CP15的原核表达载体 ,并且在大肠杆菌中表达。 方法 用HindⅢ和EcoRⅠ酶分别从pET 2 8a(+ )和 pMD18 T 15质粒中酶切得到线性片段和CP15基因片段 ,然后用T4DNA连接酶连接 ,构建重组的CP15的原核表达载体 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3 )中表达 ,并用SDS PAGE、ELISA和Westernblotting进行鉴定。 结果 构建了CP15的原核表达载体 ,得到了一分子质量约为 15ku的融合蛋白 ,占大肠杆菌总蛋白的 3 8%。 结论 CP15融合蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。

微小隐孢子虫CP15基因高效真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

目的 :构建隐孢子虫CP15真核表达载体pCR3 1 15 ,观察其在Hela细胞中的表达。方法 :用BglⅡ从pMD18 T 15中酶切得到CP15基因 ,将其插入真核表达载体pCR3 1(+)的BamHⅠ位点 ,构建CP15真核表达载体pCR3 1 15 ,脂质体介导法将其转染Hela细胞 ,并用G4 18加压筛选 ,用RT PCR方法检测外源CP15基因的转录 ,用ELISA法和间接免疫荧光法检测其活性。结果 :酶切鉴定表明已成功构建了重组真核表达载体pCR3 1 15 ;外源CP15基因能在转染细胞中有效转录 ;ELISA法和间接免疫荧光法实验结果表明表达产物具有良好的生物活性。结论 :构建的pCR3 1 15真核表达载体在Hela细胞中具有良好的表达活性。