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猪ECR1-Like免疫黏附功能对PAMs捕获GFP-E.coli的影响
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作者 张峥 凌小雅 +5 位作者 范阔海 孙娜 孙盼盼 孙耀贵 李宏全 尹伟 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2023年第19期3905-3916,共12页
【目的】探讨猪红细胞类Ⅰ型补体受体(erythrocyte complement receptor type 1-like,ECR1-like)免疫黏附功能是否能够促进猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)捕获致敏基因工程菌(GFP-Escherichia coli,GFP-E.coli),以... 【目的】探讨猪红细胞类Ⅰ型补体受体(erythrocyte complement receptor type 1-like,ECR1-like)免疫黏附功能是否能够促进猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)捕获致敏基因工程菌(GFP-Escherichia coli,GFP-E.coli),以期阐释猪红细胞免疫的分子机理及红细胞免疫在机体先天免疫中的作用。【方法】利用流式细胞术、菌落平板计数及RT-PCR技术检测PAMs捕获的GFP-E.coli的水平,分析猪ECR1-like免疫黏附对PAMs捕获GFP-E.coli的影响;运用流式细胞术、细胞免疫荧光化学技术检测猪ECR1-like免疫黏附的致敏GFP-E.coli被PAMs移除后,猪红细胞免疫黏附功能的变化及猪ECR1-like数量的变化。【结果】流式细胞术检测发现猪红细胞黏附组较空白对照组中的PAMs平均荧光强度显著提高(P<0.001),且PAMs阳性细胞率也显著提高(P<0.05);菌落涂板计数发现红细胞黏附组较空白对照组PAMs捕获GFP-E.coli情况显著增强(P<0.05);RT-PCR检测发现,红细胞黏附组PAMs中GFP-E.coli的相对数量显著高于空白对照组(P<0.01);进一步阻断猪红细胞表面的CR1-like,流式细胞术检测发现PAMs平均荧光强度降低至256301.56±9208.85(P<0.001),PAMs阳性细胞率降低至(88.32±0.92)%(P>0.05),菌落平板计数发现PAMs捕获GFP-E.coli情况减弱为(136666±8818)CFU/mL(P<0.05),RT-PCR检测发现PAMs中GFP-E.coli的相对数量显著减少(P<0.01);利用细胞流动循环互作技术发现:猪红细胞免疫黏附致敏GFP-E.coli的平均荧光强度由循环前2892.18±47.76降至2407.43±141.78(P<0.05),阳性细胞率由循环前(20.58±0.36)%降至(17.39±0.23)%(P<0.001),黏附水平显著低于循环前,与此同时,间接免疫荧光试验结果显示:试验组循环后猪ECR1-like平均荧光强度由循环前344.33±37.92降低至291.56±11.99(P<0.05),阳性细胞率由(30.20±1.24)%减少至(28.27±0.64)%(P<0.05)。【结论】猪ECR1-like通过免疫黏附功能促进了PAMs对致敏GFP-E.coli的捕获。PAMs移除猪红细胞表面黏附的致敏GFP-E.coli后,猪红细胞的活性CR1-like减少,免疫黏附功能下降。 展开更多
关键词 红细胞 猪肺泡巨噬细胞 类Ⅰ型补体受体 免疫黏附
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长白猪CR1-like基因单核苷酸多态性和拷贝数变异的研究 被引量:2
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作者 公惟欣 尹伟 +4 位作者 王春 范阔海 孙娜 孙耀贵 李宏全 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2018年第11期113-118,254,255,共8页
为了研究CR1-like基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和拷贝数变异(copy number variation,CNV),分析CR1-like的基因与蛋白质表达量、基因与蛋白质分子质量之间的关系,试验选择41头长白猪,采用直接测序和等... 为了研究CR1-like基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)和拷贝数变异(copy number variation,CNV),分析CR1-like的基因与蛋白质表达量、基因与蛋白质分子质量之间的关系,试验选择41头长白猪,采用直接测序和等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)技术检测了CR1-like基因的SNP;用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术和2-ΔΔCt相对定量分析方法检测了CR1-like基因的CNV,并利用一般线性模型(general linear model,GLM)和相关分析检验了CR1-like基因多态性与猪红细胞CR1-like蛋白质性状的关联性。结果表明:CR1-like基因存在CNV,且长白猪CR1-like基因以拷贝数正常为主,占总数的68.30%,拷贝数缺失占总数的31.70%,拷贝正常数和拷贝缺失数间差异极显著(P〈0.01);CR1-like基因外显子上检测到8个SNP位点,rs321524247和rs330380626符合哈代-温伯格平衡且处于完全连锁(D'=1,r2=1),其中单倍型AT为主要单倍型,频率为0.915。说明CR1-like基因拷贝数对猪红细胞CR1-like蛋白质表达量有极显著影响。 展开更多
关键词 cr1-like基因 SNP CNV 多态性 AS-Pcr
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猪CR1-like蛋白酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定 被引量:1
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作者 贾瑞璞 凌小雅 +5 位作者 孙雨晨 尹伟 范阔海 孙娜 孙耀贵 李宏全 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2020年第1期5-9,共5页
为了研究猪红细胞免疫粘附病原体的分子机制,筛选能与猪红细胞类补体受体I型(CR1-like)蛋白发生相互作用的蛋白,将CR1-like36和Cr1-like811基因与pGBKT7载体连接后,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811。转化... 为了研究猪红细胞免疫粘附病原体的分子机制,筛选能与猪红细胞类补体受体I型(CR1-like)蛋白发生相互作用的蛋白,将CR1-like36和Cr1-like811基因与pGBKT7载体连接后,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811。转化入酵母细胞Y2HGold中,检测融合蛋白的表达及其对酵母细胞的毒性和自激活现象。结果表明,CR1-like基因成功连接到pGBKT7载体,重组质粒表达的融合蛋白对酵母细胞无毒性作用,也无自激活现象。成功构建了符合酵母双杂交系统要求的诱饵质粒pGBKT7-CR1-like36和pGBKT7-CR1-like811,为课题组后期研究猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的分子机理奠定基础。 展开更多
关键词 酵母双杂交 cr1-like蛋白 诱饵载体
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PAMs免疫粘附受体CR 1-like对PRRSV感染的影响
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作者 张峥 孙雨晨 +5 位作者 范阔海 孙娜 孙盼盼 孙耀贵 李宏全 尹伟 《山西农业大学学报(自然科学版)》 CAS 北大核心 2023年第2期100-110,共11页
[目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndr... [目的]本试验旨在探讨猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophages,PAMs)表面天然免疫粘附受体—猪I型补体受体(Porcine complement receptor 1⁃like,CR1⁃like)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respi⁃ratory syndrome virus,PRRSV)感染PAMs的影响,为阐述CR1⁃like在PRRSV免疫应答中的生物学功能提供理论数据。[方法]采取PRRSV减毒活疫苗免疫接种PRRSV抗体为阴性的长白仔猪20~28 d后,提取分离抗病毒血清并检测抗PRRSV血清中和效价;将抗PRRSV血清进行不同倍比稀释,制备各类PRRSV抗原抗体复合物并接种于PAMs上,建立抗体依赖性增强(Antibody⁃dependent enhancement,ADE)模型,qRT⁃PCR技术检测各时间点PRRSV N基因拷贝数变化;PRRSV感染PAMs 9 h后,将抗血清和猪新鲜血清共处理细胞,运用ELISA测定不同时间点细胞上清液中猪新鲜血清C3b、C4b、CH50总活性;将PAMs分为试验组(PRRSV感染PAMs 9 h后同时加入抗血清和猪新鲜血清)和6个对照组,采用qRT⁃PCR技术检测各组不同时间点胞内和上清中PRRSV N基因的拷贝数,确定猪新鲜血清对PRRSV感染PAMs的作用;采用免疫阻断技术将PAMs分为FcR McAb阻断组、CR1⁃like McAb阻断组、共阻断组及3个对照组,qRT⁃PCR技术检测PRRSV N基因拷贝数变化,确定免疫粘附受体CR1⁃like对PRRSV感染PAMs的影响。[结果]抗PRRSV血清在PAMs上的中和抗体效价为1∶5.37;qRT⁃PCR结果成功筛选出1:20稀释度的抗PRRSV血清对病毒的复制具有促进作用;ELISA检测猪新鲜血清C3b、C4b和CH50浓度随PRRSV感染时间延长呈降低趋势;qRT⁃PCR结果显示,猪新鲜血清可以与1∶20稀释度抗PRRSV血清协同促进PRRSV的复制;qRT⁃PCR、免疫阻断技术得出1∶20稀释度抗PRRSV血清、猪新鲜血清协同促进PRRSV感染增强不只依赖于FcR,还与CR1⁃like有关。[结论]体外条件下,PAMs表面的CR1⁃like是介导PRRSV感染PAMs过程中产生ADE效应的分子之一,可与FcR协同促进PRRSV感染PAMs。 展开更多
关键词 cr1⁃like 猪新鲜血清 免疫粘附 PRRSV PAMs
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猪红细胞CR1-like膜分布状态的初步研究 被引量:3
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作者 尹伟 薛翼鹏 +7 位作者 姜俊兵 范阔海 孙娜 孙耀贵 马海利 李步高 王治维 李宏全 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2015年第9期985-990,共6页
为进一步研究猪红细胞的天然免疫调控机制,本研究合成免疫抗原肽段,制备获得了猪CR1-like单克隆抗体,并应用CR1-like单克隆抗体通过荧光免疫细胞化学技术观察猪红细胞CR1-like的天然分布状态,运用流式细胞检测技术检测了膜流动性变化对... 为进一步研究猪红细胞的天然免疫调控机制,本研究合成免疫抗原肽段,制备获得了猪CR1-like单克隆抗体,并应用CR1-like单克隆抗体通过荧光免疫细胞化学技术观察猪红细胞CR1-like的天然分布状态,运用流式细胞检测技术检测了膜流动性变化对猪红细胞CR1-like发挥免疫黏附功能的影响。结果显示,于荧光显微镜下观察,猪红细胞表面可见绿色荧光,且经膜固定处理的猪红细胞表面的绿色荧光分布呈片状,未经膜固定处理的猪红细胞表面的荧光点呈颗粒状分布,较膜固定组分布明显成簇化;流式细胞仪检测荧光强度发现,膜固定组、未固定组均明显高于空白对照组,差异极显著(P<0.01);同时未固定组平均荧光强度明显高于膜固定组,差异极显著(P<0.01)。证实天然状态下猪红细胞表面的CR1-like分布呈分散状态,发挥免疫功能时,CR1-like表现出多价高效的结合特性,其分布状态表现为颗粒样成簇分布。 展开更多
关键词 cr1-like单克隆抗体 分布状态 膜流动性 免疫黏附
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猪红细胞免疫黏附功能与CR1-like表达水平的研究 被引量:3
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作者 张静静 王春 +5 位作者 贾瑞璞 尹伟 范阔海 孙娜 孙耀贵 李宏全 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2018年第5期593-604,共12页
本研究旨在探讨不同长白猪红细胞CR1-like表达量的差异性,以及CR1-like表达量与免疫黏附功能的关系,为后期研究猪红细胞CR1-like的免疫机理提供理论数据。运用流式细胞术检测长白猪红细胞免疫黏附荧光大肠杆菌的水平及红细胞CR1-like表... 本研究旨在探讨不同长白猪红细胞CR1-like表达量的差异性,以及CR1-like表达量与免疫黏附功能的关系,为后期研究猪红细胞CR1-like的免疫机理提供理论数据。运用流式细胞术检测长白猪红细胞免疫黏附荧光大肠杆菌的水平及红细胞CR1-like表达量,运用单因素方差分析、单样本Kolmogorov-Smirnov检验等多种统计方法分析红细胞CR1-like表达量的特点及其与免疫黏附功能之间的相关性。结果,猪红细胞免疫黏附功能在个体水平上分为低,中和高三种类型,各种类型的平均荧光值依次为33.897±3.294(34.483%)、68.076±12.145(46.552%)和129.232±8.143(18.966%);CR1-like表达量在个体水平上分为低,中和高三种类型,各种类型的平均荧光值依次为21.479±0.865(14.583%)、27.984±2.218(81.034%)和36.690±0.058(6.897%);相关性分析结果显示,红细胞免疫黏附水平与CR1-like表达水平达到显著相关程度(r=0.835,P〈0.01),通过回归分析,获得二者符合典型的S曲线(lny=7.817-102.911x,r2=0.729,P〈0.01)。上述结果表明,不同的长白猪个体的红细胞CR1-like表达量具有差异性,且该特点与猪红细胞免疫黏附水平具有相关性。 展开更多
关键词 红细胞cr1-like 免疫黏附 表达量 差异性 相关性
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猪Ⅰ型补体受体与C3b活性片段相互结合的体外检测 被引量:2
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作者 孙雨晨 贾瑞璞 +5 位作者 范阔海 孙娜 孙耀贵 孙盼盼 李宏全 尹伟 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2021年第19期4243-4254,共12页
【目的】检测猪红细胞类补体受体Ⅰ型(Complement receptor 1-like,CR1-like)与C3b活性片段能否发生结合,以期为阐明猪红细胞发挥免疫粘附功能的分子机理提供科学数据。【方法】利用前期已构建的CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)功能域... 【目的】检测猪红细胞类补体受体Ⅰ型(Complement receptor 1-like,CR1-like)与C3b活性片段能否发生结合,以期为阐明猪红细胞发挥免疫粘附功能的分子机理提供科学数据。【方法】利用前期已构建的CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)功能域片段的重组质粒建立酵母双杂交检测体系,运用酵母共转化的方法将诱饵质粒(重组pGBKT7-CR1-like)与捕获质粒(重组pGADT7-C3b)共同转入Y2HGold酵母细胞中,分别利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp(DD0)严格筛选共转化成功的酵母细胞,再根据报告因子是否表达来鉴别转化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Ga1 (DDO/X)、SD/-Leu/-Trp/X-α-Ga1/Aba (DDO/X/A)二缺培养板上的生长情况,并结合菌落的颜色变化现象综合判定CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞中是否发生相互结合;然后运用免疫沉淀技术分离酵母细胞中CR1-like与C3b结合复合物,并对该复合物的特异性进行Western blot鉴定。【结果】试验成功将pGBKT7-CR1-like与pGADT7-C3b基因共转入Y2HGold酵母细胞。共转化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能够正常生长,在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生长且菌落呈现蓝色,由此表明,试验中酵母双杂交系统建立成功,并通过试验获得了阳性酵母克隆。共同转化了 pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b质粒的酵母菌落PCR反向鉴定结果显示,在共转化的酵母菌中含有目的基因CR1-like_(3-6)和CR1-like_(8-11),共转化组的质粒酶切后出现C3b基因片段,与设计大小一致,说明重组质粒成功共转化入酵母细胞中。免疫沉淀试验中应用pGBKT7载体的标签抗体c-Myc沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以c-Myc为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在 50 kD 处出现特异性条带;共转化 pGBKT7-CR1-like_(3-6)+pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like(8-11)+pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83kD处出现特异性条带;以HA单克隆抗体为一抗进行Western blot检测时,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,只有3、4泳道中共转化的酵母融合蛋白在83kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在CR1-like与C3b识别结合的复合物。使用CR1-like单克隆抗体沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以CR1-like单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在50kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like_(3-6)+pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like_(8-11)+pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83kD处出现特异性条带;以C3单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,泳道3、4所示只有共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在具有生物活性的CR1-like与C3b识别结合的复合物。通过多个单克隆抗体杂交结果,可看出诱饵质粒的表达产物CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)片段与捕获质粒的表达产物C3b片段可在酵母细胞内发生结合。【结论】猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的识别配体为C3b,为猪红细胞CR1-like功能域分子结构的进一步解析提供了重要数据依据。 展开更多
关键词 cr1-like C3B 酵母双杂交 免疫粘附
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猪肺泡巨噬细胞膜表面类补体受体分子的鉴定 被引量:2
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作者 王春 尹伟 +3 位作者 范阔海 孙娜 孙耀贵 李宏全 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2019年第7期13-17,共5页
为了鉴定猪肺泡巨噬细胞(PAM)膜表面是否存在类补体受体Ⅰ型(CR1-like),试验采用PCR技术、SDS-PAGE电泳、Western-blot技术及流式细胞术对PAM膜表面存在的分子进行研究。结果表明:PAM中存在CR1-like基因,并且PAM膜表面存在分子质量约为5... 为了鉴定猪肺泡巨噬细胞(PAM)膜表面是否存在类补体受体Ⅰ型(CR1-like),试验采用PCR技术、SDS-PAGE电泳、Western-blot技术及流式细胞术对PAM膜表面存在的分子进行研究。结果表明:PAM中存在CR1-like基因,并且PAM膜表面存在分子质量约为55 ku的CR1-like分子;运用流式细胞术检测PAM膜表面的CR1-like分子,用CR1-like McAb处理过的PAM的平均荧光强度为3 478.14±357.11,用IgG1同型抗体处理过的PAM的平均荧光强度为1 411.89±313.33,而用单独二抗处理过的PAM的平均荧光强度为1 205.89±372.27,用CR1-like McAb处理过的PAM的荧光强度高于其他两组,且差异极显著(P<0.01),而其他两组间PAM的荧光强度差异不显著(P>0.05)。说明PAM膜表面存在CR1-like分子,其分子质量大小约为55 ku。 展开更多
关键词 猪肺泡巨噬细胞( PAM) 类补体受体Ⅰ型( cr1-like) 免疫沉淀技术 流式细胞术 单克隆抗体 膜蛋白
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酵母双杂交pGADT7-C3b重组质粒的构建与鉴定
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作者 凌小雅 贾瑞璞 +6 位作者 范阔海 孙娜 孙盼盼 孙耀贵 杨惠珍 李宏全 尹伟 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2021年第19期5-9,共5页
为了研究猪红细胞CR1-like与补体片段C3b的互作关系,试验构建符合酵母双杂交系统要求的重组质粒pGADT7-C3b,对合成的含C3b基因片段的质粒进行双酶切鉴定,运用基因重组技术将鉴定正确的C3b基因与表达载体pGADT7连接并转化至大肠杆菌DH5... 为了研究猪红细胞CR1-like与补体片段C3b的互作关系,试验构建符合酵母双杂交系统要求的重组质粒pGADT7-C3b,对合成的含C3b基因片段的质粒进行双酶切鉴定,运用基因重组技术将鉴定正确的C3b基因与表达载体pGADT7连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中筛选阳性克隆,将双酶切鉴定正确的重组质粒pGADT7-C3b转化至感受态酵母菌Y2HGold中并进行毒性检测和自激活检测。结果表明:合成的含C3b基因片段的质粒经双酶切鉴定得到的目的基因条带大小为1914 bp,将C3b基因与表达载体pGADT7连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中,然后在含Amp的LB固体培养基中长出阳性菌落,重组质粒pGADT7-C3b经双酶切鉴定得到与预期大小相符的条带,经毒性检测发现转化有重组质粒pGADT7-C3b的Y2HGold酵母菌在SD/-Leu固体培养基上正常生长,在SD/-Leu、SD/-Leu/X-a-Gal固体培养基上长出白色菌落,在SD/-Leu/X-a-Gal/Aba固体培养基上无菌落生长。说明试验成功构建了pGADT7-C3b重组质粒,对Y2HGold酵母菌无毒性和自激活作用,符合酵母双杂交系统要求。 展开更多
关键词 酵母双杂交 C3B cr1-like 重组质粒 毒性检测 自激活检测
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猪红细胞类补体受体Ⅰ型膜结合蛋白的筛选 被引量:2
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作者 张琪琪 凌小雅 +5 位作者 孙雨晨 尹伟 范阔海 孙娜 孙耀贵 李宏全 《中国兽医科学》 CAS CSCD 北大核心 2020年第1期42-48,共7页
本研究旨在鉴定猪红细胞类补体受体Ⅰ型(complement receptor 1-like,CR1-like)的膜结合蛋白,以期为探讨CR1-like在膜上分布的分子基础提供理论数据。采用免疫磁珠沉淀的方法纯化猪红细胞CR1-like,利用还原性SDS-PAGE电泳及Western-blo... 本研究旨在鉴定猪红细胞类补体受体Ⅰ型(complement receptor 1-like,CR1-like)的膜结合蛋白,以期为探讨CR1-like在膜上分布的分子基础提供理论数据。采用免疫磁珠沉淀的方法纯化猪红细胞CR1-like,利用还原性SDS-PAGE电泳及Western-blot试验,得出猪红细胞CR1-like的分子大小;利用质谱技术对纯化的CR1-like免疫沉淀复合物进行鉴定,并对质谱数据进行相关分析。CR1-like免疫沉淀复合物的还原性SDS-PAGE和Western-blot的鉴定结果显示,CR1-like分子大小约为50 ku;CR1-like免疫沉淀复合物的质谱鉴定筛选出117个候选蛋白,根据肽段数、特异肽段数、序列覆盖率、分值等及对候选蛋白的生物信息学分析筛选出FERMdomain-containing protein作为候选蛋白进行下一步试验。上述结果表明,本研究成功建立了免疫磁珠沉淀CR1-like方法,并筛选出CR1-like的膜结合候选蛋白。 展开更多
关键词 猪红细胞 cr1-like 膜结合蛋白
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