为了研究CR1-like基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）和拷贝数变异（copy number variation,CNV）,分析CR1-like的基因与蛋白质表达量、基因与蛋白质分子质量之间的关系,试验选择41头长白猪,采用直接测序和等...为了研究CR1-like基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）和拷贝数变异（copy number variation,CNV）,分析CR1-like的基因与蛋白质表达量、基因与蛋白质分子质量之间的关系,试验选择41头长白猪,采用直接测序和等位基因特异性PCR（Allele-specific PCR,AS-PCR）技术检测了CR1-like基因的SNP;用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术和2-ΔΔCt相对定量分析方法检测了CR1-like基因的CNV,并利用一般线性模型（general linear model,GLM）和相关分析检验了CR1-like基因多态性与猪红细胞CR1-like蛋白质性状的关联性。结果表明：CR1-like基因存在CNV,且长白猪CR1-like基因以拷贝数正常为主,占总数的68.30%,拷贝数缺失占总数的31.70%,拷贝正常数和拷贝缺失数间差异极显著（P〈0.01）;CR1-like基因外显子上检测到8个SNP位点,rs321524247和rs330380626符合哈代-温伯格平衡且处于完全连锁（D＇=1,r2=1）,其中单倍型AT为主要单倍型,频率为0.915。说明CR1-like基因拷贝数对猪红细胞CR1-like蛋白质表达量有极显著影响。展开更多
目的:探讨趋化因子受体CX3CR1对骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)修复受损肠上皮细胞的影响.方法:体外分离培养、鉴定BM-MSCs.采用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor a l p h a,T N F-α)处理结肠癌...目的:探讨趋化因子受体CX3CR1对骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)修复受损肠上皮细胞的影响.方法:体外分离培养、鉴定BM-MSCs.采用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor a l p h a,T N F-α)处理结肠癌上皮细胞(c o l o n adenocarcinoma epithelial cell line,Caco-2)建立肠上皮损伤模型.实验分为6组:(1)单纯BM-MSCs组;(2)单纯Caco-2组;(3)Caco-2+TNF-α组;(4)BM-MSCs+Caco-2组;(5)BMMSCs+Caco-2+TNF-α组;(6)anti-CX3CR1-BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组,利用Transwell培养板将各组共培养,通过免疫荧光、We s t e r n b l o t及荧光定量RT-P C R方法检测Caco-2上ZO-1(zonula occluden 1)、Occludin和BM-MSCs上CX3CR1蛋白及mR NA表达水平.结果:选择100 ng/mL TNF-α处理Caco-2细胞48 h建立损伤模型后,检测ZO-1和Occludin表达水平明显降低(P<0.05).在BM-MSCs与未受损的Caco-2共培养时ZO-1、Occludin和CX3CR1蛋白及m RNA的表达不受影响,而在BM-MSCs与受损Caco-2共培养时,其表达增加(P<0.05).阻断CX3CR1后,ZO-1、Occludin蛋白及m RNA的表达与未阻断前相比明显减少(P<0.05).结论:CX3CR1参与BM-MSCs对受损肠上皮的修复.展开更多
目的探讨人CRIF1基因对骨髓间充质干细胞(hBMSCs)细胞周期调控机制。方法通过构建慢病毒载体改变CRIF1表达水平,合成发夹shRNA模板寡核苷酸链,构建pGreenPuro-sh-CRIF1干扰载体;PCR扩增CRIF1基因CDS全长,链接pMD18-T载体经测序鉴定后,构...目的探讨人CRIF1基因对骨髓间充质干细胞(hBMSCs)细胞周期调控机制。方法通过构建慢病毒载体改变CRIF1表达水平,合成发夹shRNA模板寡核苷酸链,构建pGreenPuro-sh-CRIF1干扰载体;PCR扩增CRIF1基因CDS全长,链接pMD18-T载体经测序鉴定后,构建pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP过表达载体。载体成功构建后包装慢病毒,并转染hBMSCs,以pLentis-CMV-SFFV-GTP空载体病毒作为对照,定量PCR及Western blot(WB)检测CRIF1基因和蛋白表达,流式细胞仪检测hBMSCs细胞周期分布,并通过免疫荧光观察CRIF1与CDK2细胞共定位。结果成功构建CRIF1 shRNA及过表达慢病毒载体,测定后病毒滴度达到108TU/mL。以MOI=10转染hBMSCs,并以0.8μg/mL嘌呤霉素筛选1周后,感染效率可达到>95%,WB及定量PCR证实,CRIF1基因和蛋白的表达水平,在pGreenPuro-sh-CRIF1载体转染后hBMSCs细胞受到抑制:与对照组比较,mRNA相对表达水平0.42±0.03 vs1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平0.13±0.024 vs 1.00±0.04(P<0.01),而pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP载体转染后得到增强:与对照组比较,mRNA相对表达水平5.54±0.53 vs 1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平4.21±0.22 vs 1.00±0.04(P<0.01)。同时,CRIF1基因过表达诱导hBMSCs G0/G1期阻滞(与对照组比较,84.99±2.66 vs 77.28±0.86,P<0.01),抑制CRIF1基因表达促进其进入细胞周期循环:G0/G1期比例与对照组比较,61.60±3.02 vs 77.28±0.86(P<0.01)。激光共聚焦显示,CRIF1与CDK2共定位于胞浆与胞核。结论 CRIF1可能通过与CDK2结合,负性调控hBMSCs细胞周期分布。展开更多
文摘为了研究CR1-like基因的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）和拷贝数变异（copy number variation,CNV）,分析CR1-like的基因与蛋白质表达量、基因与蛋白质分子质量之间的关系,试验选择41头长白猪,采用直接测序和等位基因特异性PCR（Allele-specific PCR,AS-PCR）技术检测了CR1-like基因的SNP;用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）技术和2-ΔΔCt相对定量分析方法检测了CR1-like基因的CNV,并利用一般线性模型（general linear model,GLM）和相关分析检验了CR1-like基因多态性与猪红细胞CR1-like蛋白质性状的关联性。结果表明：CR1-like基因存在CNV,且长白猪CR1-like基因以拷贝数正常为主,占总数的68.30%,拷贝数缺失占总数的31.70%,拷贝正常数和拷贝缺失数间差异极显著（P〈0.01）;CR1-like基因外显子上检测到8个SNP位点,rs321524247和rs330380626符合哈代-温伯格平衡且处于完全连锁（D＇=1,r2=1）,其中单倍型AT为主要单倍型,频率为0.915。说明CR1-like基因拷贝数对猪红细胞CR1-like蛋白质表达量有极显著影响。
文摘目的:探讨趋化因子受体CX3CR1对骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)修复受损肠上皮细胞的影响.方法:体外分离培养、鉴定BM-MSCs.采用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor a l p h a,T N F-α)处理结肠癌上皮细胞(c o l o n adenocarcinoma epithelial cell line,Caco-2)建立肠上皮损伤模型.实验分为6组:(1)单纯BM-MSCs组;(2)单纯Caco-2组;(3)Caco-2+TNF-α组;(4)BM-MSCs+Caco-2组;(5)BMMSCs+Caco-2+TNF-α组;(6)anti-CX3CR1-BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组,利用Transwell培养板将各组共培养,通过免疫荧光、We s t e r n b l o t及荧光定量RT-P C R方法检测Caco-2上ZO-1(zonula occluden 1)、Occludin和BM-MSCs上CX3CR1蛋白及mR NA表达水平.结果:选择100 ng/mL TNF-α处理Caco-2细胞48 h建立损伤模型后,检测ZO-1和Occludin表达水平明显降低(P<0.05).在BM-MSCs与未受损的Caco-2共培养时ZO-1、Occludin和CX3CR1蛋白及m RNA的表达不受影响,而在BM-MSCs与受损Caco-2共培养时,其表达增加(P<0.05).阻断CX3CR1后,ZO-1、Occludin蛋白及m RNA的表达与未阻断前相比明显减少(P<0.05).结论:CX3CR1参与BM-MSCs对受损肠上皮的修复.
文摘目的探讨人CRIF1基因对骨髓间充质干细胞(hBMSCs)细胞周期调控机制。方法通过构建慢病毒载体改变CRIF1表达水平,合成发夹shRNA模板寡核苷酸链,构建pGreenPuro-sh-CRIF1干扰载体;PCR扩增CRIF1基因CDS全长,链接pMD18-T载体经测序鉴定后,构建pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP过表达载体。载体成功构建后包装慢病毒,并转染hBMSCs,以pLentis-CMV-SFFV-GTP空载体病毒作为对照,定量PCR及Western blot(WB)检测CRIF1基因和蛋白表达,流式细胞仪检测hBMSCs细胞周期分布,并通过免疫荧光观察CRIF1与CDK2细胞共定位。结果成功构建CRIF1 shRNA及过表达慢病毒载体,测定后病毒滴度达到108TU/mL。以MOI=10转染hBMSCs,并以0.8μg/mL嘌呤霉素筛选1周后,感染效率可达到>95%,WB及定量PCR证实,CRIF1基因和蛋白的表达水平,在pGreenPuro-sh-CRIF1载体转染后hBMSCs细胞受到抑制:与对照组比较,mRNA相对表达水平0.42±0.03 vs1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平0.13±0.024 vs 1.00±0.04(P<0.01),而pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP载体转染后得到增强:与对照组比较,mRNA相对表达水平5.54±0.53 vs 1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平4.21±0.22 vs 1.00±0.04(P<0.01)。同时,CRIF1基因过表达诱导hBMSCs G0/G1期阻滞(与对照组比较,84.99±2.66 vs 77.28±0.86,P<0.01),抑制CRIF1基因表达促进其进入细胞周期循环:G0/G1期比例与对照组比较,61.60±3.02 vs 77.28±0.86(P<0.01)。激光共聚焦显示,CRIF1与CDK2共定位于胞浆与胞核。结论 CRIF1可能通过与CDK2结合,负性调控hBMSCs细胞周期分布。
