近江牡蛎C型凝集素CRD结构域PAMPs结合谱及抑菌活性

[目的]揭示C型凝集素(CTL)在近江牡蛎固有免疫防御机制中的重要作用。[方法]采用基因克隆、蛋白表达等技术进行试验。[结果]克隆获得1种近江牡蛎CTL基因,其CDS区1350 bp,编码449个氨基酸,含1个CRD结构域,Ca^(2+)结合位点2关键氨基酸基序为QPS/WHD;CTL mRNA相对表达呈组织差异分布,肝胰腺、外套膜、血细胞表达量较高,其次为鳃、肌肉柱、卵巢,唇瓣表达量最少;CTL的CRD结构域体外重组蛋白具有LPS、PGN和glucan 3种PAMPs结合活性,能结合、抑制和杀死革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性菌中的大肠杆菌和鳗弧菌,能结合、抑制但不能杀死毕赤酵母和耶罗维亚酵母。[结论]近江牡蛎CTL的CRD结构域具有较广泛的PAMPs结合谱和抑菌活性,在其固有免疫防御机制中可发挥识别、结合、抑制和杀死多种有害菌的重要作用。

用SDSL-EPR技术测量LSECtin-CRD与甘露糖结合过程中的位点运动性变化

目的:应用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测肝脏及淋巴结窦内皮细胞C型凝集素(LSECtin)的糖基识别结构域CRD上不同位点氨基酸的运动特性及其与甘露糖结合过程中的构象变化。方法:通过SOE-PCR方法对LSECtin-CRD引入半胱氨酸点突变,构建p ET28b-Tat-LSECtin-CRD载体,可溶性表达LSECtin-CRD突变体蛋白;对突变位点进行自旋标记;EPR检测标记后样品的EPR波谱;用SS-FDDM软件对EPR波谱进行模拟和解析,获得旋转相关时间τc,研究其构象特点及变化。结果:在CRD的Ca^(2+)结合位点和配体结合功能区构建了5个突变体蛋白;LSECtin-CRD与Ca^(2+)和甘露糖结合后,4个位点的τc值明显升高,表明CRD结构域整体运动性降低;5个突变位点运动性差异较大,其中A258位点运动性变化最大,可能是参与糖基结合的关键位点。结论:SDSL-EPR技术能够有效研究LSECtin-CRD参与糖基结合过程中的构象运动性,研究结果证明了LSECtin-CRD在与糖基结合后整体运动性受限。

半乳糖凝集素糖结合的新模式：一个糖结合域的双重配体结合(英文)

半乳糖凝集素家族通过糖识别结构域(CRD)可以专一性识别和结合含β-半乳糖的多糖配体来发挥其生物学功能.到目前发现的CRD对β-半乳糖的识别模式是非常保守的,在结构已知的半乳糖凝集素结构中,一个CRD只能结合一个多糖配体分子.最近,通过对人源半乳糖凝聚素-3 CRD与对硝基TF二糖(TFN)复合物的晶体结构解析首次发现,一个CRD可以同时结合2个TFN分子.与这2个TFN分子有双向结合的残基突变体E165A结构分析显示,一个残基的突变引起的结构上的微小变化会使结合位点2丧失结合糖底物的能力,而位点1的配体结合却不受影响.这表明,结合位点1对糖底物保守的识别和结合是基本的、主要的,而结合位点2对于糖有条件的结合,是额外的、次要的.序列比对和立体化学分析显示,参与新位点2结合的关键残基在其他半乳糖凝集素分子中都是保守的,而它们参与糖配体结合并不常见,表明它们作用的发挥是有条件的.可能在复杂寡聚结构的情况下,如有多重分支结构,双重结合位点将有利于对这类配体分子的辨识和结合,已有一系列研究报道,具有分支结构的寡糖与半乳糖分子的亲和势明显高于单价糖配体,与上述分析相一致.对这类双重位点糖结合的可能生物学意义进行了讨论.