Cre/Loxp位点重组酶系统在疾病动物模型建立中的应用

Cre/Loxp位点重组酶系统可以迅速、有效的导致时空特异性基因片段剔除 ,从而可以在体研究某一与疾病相关的基因在特定的组织、细胞类型和特定的时间空间表达的活化或抑制的情况。本文就运用Cre/Loxp位点重组酶系统建立疾病动物模型的特点。

位点特异性重组酶Cre的克隆、表达、纯化及体外活性鉴定

克隆了Cre基因 ,分别构建了真核表达载体 pEF EBFP Cre和 pGEX Cre,在大肠杆菌中表达了Cre重组酶 ,并证明了重组酶的删除特性 。

Cre/loxP定位重组系统在植物雄不育和杂种优势中的利用研究

Cre loxP是来源于噬菌体P1的一种位点特异性重组系统。目前 ,它已广泛应用于基因功能鉴定 ,动植物及微生物基因组的修饰以及基因的表达和调控。雄性不育系在杂种优势的利用中具有重要意义。本实验是以Cre loxP系统调控细胞毒素基因barnase在植物雄性器官发育的特异时期在特异组织表达 ,从而达到控制植物育性的目的。1 在本实验中 ,通过PCR方法克隆了解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens的barnase基因 ,及其抑制因子barstar的DNA序列 ,同时 ,构建成功双元表达载体及基因枪转化载体 ,并已获得经分子检测呈阳性的小麦植株。2 osg6B是来源于水稻花药绒毡层的特异性的启动子 ,它在小孢子发育的四分体时期至单核花粉期在花药绒毡层中特异启动基因的表达 ,它具有较为严紧的时空特异性。以osg6B为启动子 ,构建了一组受控于Cre/loxP位点特异性重组系统的适用于基因枪法转化小麦的载体系统。其中 ,转不育基因(og6B barnase)小麦植株生长正常 ,但开花后 ,花粉量明显减少 ,自交不能得到正常种子。进行花粉活力检测发现 ,转基因小麦大部分花粉表现为败育。花粉离体萌发试验表明 ,转不育基因小麦的花粉离体萌发率极低 ,几近败育。说明以osg6B驱动barnase在小麦花药中的表达可以导致雄性不育。3

Cre/LoxP系统联合SV40 LTag诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体(SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞(P<0.05),在体外培养传代>25代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异(P>0.05),无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系。

启动子串联及改造提高FAD为辅基的葡萄糖脱氢酶在Bacillus subtilis中的表达

以黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)为辅基的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase with FAD,FAD-GDH,EC 1.1.99.10),与辅基结合紧密,催化效率高,是临床检测血糖指标的新型诊断用酶。将Burkholderia cepacia的FAD-GDH基因(gdh)构建含单启动P_(HpaⅡ)的穿梭质粒p MA5-1,在蛋白酶缺陷型菌株Bacillus subtilis WB600中表达。为了获得该酶的高效表达,采用启动子串联及改造策略考察产酶情况。将4种启动子(P_(amyQ’),P_(43),P_(gsiB),P_(opuaa))分别与质粒上自带的启动子P_(HpaⅡ)串联,结果表明P_(HpaⅡ)-P_(amyQ’)串联组合获得的FAD-GDH胞内酶活最高,为2 497 U/L,是串联前单启动子的2.7倍。为了减少发酵过程中,葡萄糖和甘油对产酶的抑制作用,在串联组合的基础上删去P_(amyQ’)启动子中与碳代谢调控蛋白结合的cre位点,使胞内产酶水平提高至3 626 U/L,说明cre位点的去除能够减少碳代谢产物对启动子转录的抑制。本研究为新型诊断用酶FAD-GDH的菌种改造和工业化生产应用提供参考与借鉴。

环氧化酶-2基因启动子区甲基化水平在子宫内膜异位症中的作用

目的检测环氧化酶-2(COX-2)基因启动子区CRE位点甲基化状况,探讨其在子宫内膜异位症(EMs)发生中的作用。方法收集南昌大学第一附属医院40例子宫内膜异位症患者的子宫内膜作为病例组,同期40例正常子宫内膜作为对照组,采用焦磷酸盐测序技术检测病例组和对照组子宫内膜组织中COX-2基因启动子区CRE位点甲基化频率;采用实时定量PCR及免疫组化技术分别检测病例组和对照组子宫内膜组织中COX-2 mRNA及蛋白的表达;分析COX-2基因启动子区CRE位点甲基化频率与COX-2表达水平的相关性。结果对照组内膜组织COX-2基因启动子区CRE位点的甲基化频率(40.81%±6.10%)显著高于病例组(14.74%±2.84%),P<0.05;而对照组COX-2 mRNA表达水平(0.98±0.37)及蛋白表达水平(1.00±0.73)显著低于病例组的mRNA表达水平(2.63±0.44)及蛋白表达水平(2.74±1.18),P均<0.05。随着COX-2基因启动子区CRE位点甲基化频率升高,COX-2基因表达水平下降,二者呈负相关(P<0.05)。结论 COX-2基因启动子区CRE位点去甲基化与EM s患者在位内膜COX-2高表达相关,在EM s的发生、发展中具有重要作用,提示子宫内膜异位症是一种表观遗传性疾病。

携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。