基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型gp41 NHR结构域亚单位疫苗的研究

目的:构建基于中国HIV-1 CRF01_AE重组亚型包膜糖蛋白gp41 NHR结构域N51的亚单位疫苗,并进行免疫原性研究。方法:设计4条引物,运用重叠延伸PCR方法扩增出N51Fd基因,将其插入真核表达载体pFUSE-hIgG1-Fc2,构建重组质粒pFUSE/N51Fd并进行序列测定。Western blot法检测N51FdFc-AE重组蛋白的表达。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后,ELISA法检测小鼠的抗体反应。结果:成功构建了pFUSE/N51Fd重组质粒,N51FdFc-AE重组蛋白在真核体系获得了高效表达,Western blot结果显示在相对分子质量(Mr)35 000处有目的蛋白条带。小鼠抗血清能特异性识别源于gp41 NHR的抗原,效价高达1∶102 400,平均效价为1∶51 200。结论:改造后的亚单位疫苗能有效激活机体的免疫响应,可用于HIV候选疫苗的研发。

HIV-1 CRF01_AE毒株gp41蛋白生物信息学预测

目的:对HIV-1 gp41蛋白的膜外区和跨膜区进行预测,并分析该蛋白的结构和功能。方法:从NCBI GenBank数据库获取gp41基因及其蛋白编码序列,利用ExPASy ProtParam tool、ProtScale、SignalP 4.0 Server、TMHMM Server v.2.0、SWISSMODEL、PredictProtein等工具对gp41蛋白的生物学特性进行预测。结果:HIV-1 gp41基因ORF长度为666 bp,编码222个氨基酸,蛋白分子式为C1164H1815N317O325S6,等电点(isoelectric point,pI)=8.60,属于稳定、疏水性蛋白。该蛋白具有跨膜区,信号肽切割位点位于第20和21位氨基酸处。其二级结构由无规则卷曲、β折叠和α螺旋组成,属于全螺旋型蛋白。而且该蛋白具有N-端信号肽,能引导蛋白分泌到胞外。此外gp41蛋白具有4个蛋白质-蛋白质和1个蛋白质-核酸结合位点,这些位点能调控gp41蛋白的多种生物学功能。结论:对gp41蛋白的结构和功能进行了预测,为深入研究其参与疾病发生发展的分子机制奠定了基础。

人类免疫缺陷病毒-1 CRF01_AE毒株在我国的分子传播网络分析

目的构建我国HIV-1 CRF01_AE毒株分子传播网络，并分析网络特征。方法从洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV基因数据库（Los Alamos database）下载中国地区的CRF01_AE pol区基因序列并进行人口学信息核对。通过构建系统进化树、提取传播簇、最小基因距离选择及传播网络可视化4个步骤构建传播网络。运用卡方检验分析不同人群参与网络形成的比例和网络中度的分布。描述性分析不同人群和不同地区之间的传播关联。结果2 419条序列共形成250个大小介于2～25的传播网络，包括847个节点和610条边。度≥2的个体虽然只占网络中个体总数的26.4%（224/847），但与66.5%（563/847）的个体存在关联。男男同性性行为者（MSM）、男性异性性行为者、静脉药瘾者（IDUs）及女性异性性行为者参与网络形成的比例分别为37.6%（669/1 781）、28.4%（102/359）、16.1%（10/62）和30.4%（66/217），差异有统计学意义（χ^2＝23.774，P〈0.001）。MSM人群中度≥2的比例（10.8%，193/1 781）显著高于男性异性性行为者（5.6%，20/359）和女性异性性行为者（4.6%，10/217）（P值分别为0.002和0.004）。网络中绝大多数（95.5%，639/669）MSM与其他MSM之间存在传播关联，仅有2.4%（16/669）的个体与女性异性性行为者之间存在传播关联，但有15.1%（10/66）的女性异性性行为者与MSM之间存在传播关联。男性异性性行为者与女性异性性行为者之间存在传播关联的比例为35.3%（36/102），与MSM之间具有传播关联的比例为9.8%（10/102）。网络中20.9%（177/847）的个体与其他省份之间存在传播关联。结论较少比例的超级传播者在CRF01_AE毒株的分子传播网络形成中起到了核心作用，不同人群和不同地区之间的毒株进行着活跃的传播。

四川省彭州市HIV-1 CRF01_AE毒株分子网络特征分析

目的了解彭州市HIV-1 CRF01_AE毒株的分子网络特征及相关因素,为精准防控提供参考依据。方法收集2019年3月至2022年8月彭州市新报告HIV-1感染者血样,采用巢式PCR法扩增样本pol区基因并测序,使用基因距离法构建分子网络并分析其特征,采用χ^(2)检验和Logistic回归分析入网的影响因素。结果采集目标人群血样699份,经扩增获得667条序列,其中CRF01_AE毒株序列335条,基因距离在0.7%时CRF01_AE毒株成簇数最高,186条序列入网,入网率为55.52%,形成45个簇,在彭州市辖的12个街道/乡镇均有分布。入网影响因素分析结果显示,相比于19~49岁,≥50岁(OR=1.57,95%CI:1.78~3.17)的感染者更容易进入网络;相比于高中及以上文化程度,小学及以下文化程度(OR=4.64,95%CI:1.48~14.59)的感染者更容易进入网络;相比于LC镇,DJS镇(OR=0.22,95%CI:0.05~0.99)、GH镇(OR=0.19,95%CI:0.04~0.80)和TP街道(OR=0.34,95%CI:0.16~0.76)的感染者更不容易进入网络。网络中存在高危传播者45例(24.19%,45/186),以男性(68.89%,31/45)、≥50岁(93.33%,42/45)、异性性传播(100.00%,45/45)为主;高风险分子簇3个,分别包含26、22和19例感染者,49.25%(33/67)的感染者存在非婚商业异性性接触史。结论彭州市HIV-1 CRF01_AE毒株传播风险较高,传播范围较广,应加强对CRF01_AE毒株的长期动态监测,针对重点街道/乡镇和高风险传播者采取精准防控,加强对商业异性性行为的干预,减少新发感染。

人类免疫缺陷病毒-1CRF01_AE毒株在我国的分子流行特征分析

目的了解HIV-1CRF01_AE毒株在我国的分子流行特征。方法计算机检索相关数据库并结合文献追溯的方法提取数据，按地区和研究人群分组进行Meta分析，计算HIV-1CRF01_AE感染者占不同高危人群的比例。从美国洛斯阿拉莫斯国家实验室HIV基因数据库（LosAlamosdatabase）中下载中国地区的CRF01_AEpol区基因序列，利用FastTree2．1构建系统进化树进行成簇分析。根据BEASTV1．6．2和Spread计算贝叶斯因子分析空间地理传播关联。结果HIV-1CRF01_AE毒株在我国6个地区的MSM人群中所占比例均〉45．0％；在东部、北部、西南和中南地区的异性性行为人群中所占比例均〉30．0％；在中南地区的静脉药瘾人群中所占比例最高，为57．3％（95％CI：35．1％～79．6％）；而输血传播人群仅在中南地区占有较低的比例，为10．6％（95％CI：6．2％～14．9％）。系统进化分析表明，该毒株在我国形成7个独立的传播簇，其中簇1、3、5主要流行于异性性行为感染人群中，簇2及簇6主要流行于MSM人群中，簇4主要流行于性行为感染人群中。簇1～5均在西南地区流行，中南地区主要流行簇7和簇1，北部地区主要流行簇2和簇6，东部地区主要流行簇2和簇4，东北地区主要流行簇6。贝叶斯因子分析结果显示，该毒株在我国东部、中南部、西南部、北部及东北部的省份之间传播关系错综复杂。结论CRF01_AE毒株活跃在我国各个地区的多个高危人群中，不同地区之间的传播关联错综复杂。

艾滋病病毒1型CRF01_AE毒株的过去、现在和将来

CRF01_AE是我国目前流行的主要HIV-1毒株，具有独特的流行病学特征。本文从该毒株的发现起源与命名、在国内外的流行过程、参与形成的重组毒株以及致病性等方面进行介绍，并讨论了与流行病学特征密切相关的社会和生物学因素。

长春市HIV感染者病毒基因亚型分布状况及CRF01_AE毒株基因特征

目的了解长春市艾滋病病毒（HIV）感染者病毒基因亚型分布状况及当前主要流行株CRF01_AE毒株的基因变异特征。方法采集HIV感染者血液标本,提取病毒核糖核酸（RNA）,应用巢式聚合酶链反应对HIV的gag区（HXB2：863~1486）基因进行扩增并测序。PhyML3.0软件构建系统进化树,采用HIV database数据库中Entropy、N-Glycosite、VESPA对CRF01_AE毒株两个独立进化簇的氨基酸多态性、糖基化位点、特征性氨基酸进行分析。结果成功测得gag序列的97例感染者中,经男男同性传播感染者71例（73.2%）;经异性传播感染者13例（13.4%）,双向传播感染者1例,12例感染途径未知。基因亚型分析结果显示,CRF01_AE 73例（75.3%）,CRF07-BC 18例（18.6%）,B亚型5例（5.2%）。URFs1例（0.1%）。系统进化树显示CRF01_AE在感染者中形成两个独立的进化簇,其中簇Ⅰ44株（61.1%）,簇Ⅱ28株（38.9%）。进一步对CRF01_AE两个进化簇分析显示：这两个独立进化簇有10个特征性氨基酸存在差异,簇Ⅰ糖基化位点多态性大于簇Ⅱ,但氨基酸位点多态性小于簇Ⅱ。结论长春市HIV感染者主要以男男同性接触感染为主,CRF01_AE已成为本地最主要流行株。CRF01_AE毒株流行簇Ⅰ和Ⅱ存在特征性氨基酸,糖基化位点和氨基酸位点存在多态性差异,提示应密切关注本地区HIV的基因变异特征。

上海市男男性行为者中感染HIV-1的CRF01_AE毒株传播簇分析

目的了解上海地区男男性行为者(MSM)中,感染艾滋病病毒1型(HIV-1)的CRF01_AE重组型的流行情况、成簇特性,为HIV防控工作提供科学数据。方法从2009-2013年每年新诊断的MSM HIV-1感染者血浆样本中提取RNA,并对HIV-1 pol基因片段进行反转录和巢式PCR扩增、DNA测序和亚型分析。对CRF01_AE重组型序列进行系统进化学和社会人口学信息分析。结果 1262名MSM感染者中,CRF01_AE重组型感染782人(62.0%),其序列在系统进化树上形成6个流行簇。使用不同参数界定传播簇并进行比较,选择以Bootstrap≥90%及基因距离≤0.03作为传播簇的界定标准,形成112个传播簇,其中由10条及以上序列形成的传播簇有5个;年龄、文化程度、婚姻状况、性病史和CD4+T淋巴细胞计数与样本的成簇性有统计学关联。结论 CRF01_AE重组型毒株是上海市MSM HIV-1感染者中的优势传播株,具有较强的成簇性,并且与相关的社会人口学和流行病学背景相关。

1992--2008年深圳HIV-1CRF01_AE重组株的流行趋势与进化规律

目的了解HIV-1CRF01_AE重组株在深圳地区的流行情况，并分析其流行趋势及进化规律。方法收集深圳地区1992--2008年HIV确认阳性血液样本489份，应用巢式聚合酶链反应（Nested-PCR）技术，对样本膜蛋白（Env）基因进行扩增，并对其基因区核苷酸序列进行测定，判定亚型结果。对获得的CRF01_AE重组株核酸序列进行系统进化分析，并计算基因离散率。结果共有465份样本获得分型结果，其中CRF01_AE重组株样本300份（占64．5％）。1992-1999、2000—2005和2006--2008年3个时间段CRF01_AE重组株所占比例分别为56．8％（21／37）、68．4％（78／114）和64．0％（201／314）；在这3个时间段内，经异性性传播的比例分别为52．4％（11／21）、43．6％（34／78）和45．8％（92／201），经同性性传播的比率上升明显，分别为4．8％（1／21）、0．0％（0／78）和22．4％（45／201），经吸毒传播的比例分别为19．0％（4／21）、51．3％（40／78）和30．8％（62／210）。系统进化分析发现，不同时间段的样本出现明显的时间聚集现象，并伴有传播途径的聚集及交叉感染现象。各时间段CRF01_AE重组株组内基因离散率分别为（8．783±4．717）％、（11．054±7．141）％、（13．218±4．080）％，有明显的增大趋势。结论HIV-1CRF01_AE重组株是深圳地区的主要流行株，主要经异性性行为、同性恋和吸毒人群传播，随着时间的推移毒株变异程度逐渐增大。

广东省人类免疫缺陷病毒1型CRF01＿AE毒株膜区V3环氨基酸序列多态性分析

目的分析广东省人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)CRF01_AE毒株膜蛋白第三高变区(V3环)氨基酸序列的特点。方法提取HIV-1 CRF01_AE亚型感染者PBMC中前病毒DNA,巢式PCR扩增HIV-1膜基因c2v3c3区域后测序,对V3环氨基酸序列特征进行分析。结果 73份样本与HIV-1 CRF01_AE亚型代表毒株聚集在一起、与其他亚型标准毒株分开,进一步证实本研究73例HIV/AIDS患者感染的HIV-1毒株为CRF01_AE亚型。除6个位点氨基酸一致外,73例病人所有V3环序列的其他29个位点分别有2～8个不同的氨基酸出现;GPGQ为V3环顶端四肽的主要形式,占47.9%,其次为GPGK,占15.1%,四肽中未出现多态性的只有第三位氨基酸;预测HIV-1辅助受体为CCR5的有35例,占47.9%,其次为CXCR4的有34例,占46.6%,两者之间差异无统计学意义(P>0.05)。性传播是广东省CRF01_AE亚型HIV-1感染者的主要感染途径,占54.8%,其次是静脉吸毒,占30.2%。通过性传播途径感染的HIV-1毒株的辅助受体主要为CXCR4,占52.5%,辅助受体为CCR5的占40.0%,两者相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论广东省人类免疫缺陷病毒1型CRF01_AE毒株膜区V3环氨基酸存在较高的多态性,使用CCR5及CXCR4为辅助受体的HIV-1毒株比例相近。

我国HIV-1 CRF01_AE毒株辅助受体利用的基因预测可行性研究

目的探讨HIV-1辅助受体基因预测工具对我国流行的CRF01_AE毒株辅助受体利用的可行性。方法从北京市、广西壮族自治区、四川省的HIV-1感染者中分离出CRF01_AE毒株22株,利用基因型方法(11/25规则、WebPSSM和geno2pheno)对病毒辅助受体利用情况进行预测,将预测结果与经GHOST细胞系检测的表型实验结果进行比较。结果经GHOST细胞系检测,22株CRF01_AE毒株中,4株利用CCR5/CXCR4辅助受体,18株利用CCR5辅助受体。11/25规则预测与表型实验的一致率为86.4%;geno2pheno中,G2p-clinical、NGS-sanger和G2p-colon模型预测与表型实验的一致率分别为95.5%、86.4%和68.2%;WebPSSM中,PSSM-sinsi_B、PSSM-x4r5和PSSM-sinsi_C模型预测与表型实验的一致率分别为86.4%、72.7%和45.5%。结论对于我国CRF01_AE毒株的HIV-1感染者,在使用辅助受体拮抗剂之前应进行辅助受体利用的预测,Geno2pheno是较准确的辅助受体基因预测工具。

南京地区HIV-1 CRF01_AE毒株分子流行特征及传播网络分析

目的 了解南京地区HIV-1 CRF01_AE毒株分子流行特征及传播网络情况,为该毒株的疫情防控提供参考依据。方法 收集2015年9月至2019年6月南京市新确诊的HIV-1感染者血样及人口学信息。扩增HIV-1 pol区基因片段,经判定CRF01_AE毒株共401条。以最大似然法构建系统进化树;通过Tamura-Nei 93成对基因距离法构建传播网络并分析其特征。结果 CRF01_AE毒株在南京地区共形成了3个全国相关流行枝(Clade 4a、Clade 4b、Clade 5)以及1个独特的南京流行枝(NJ-Clade),这4个流行枝分别包括23.69%(95/401)、18.20%(73/401)、13.72%(55/401)和30.92%(124/401)的南京序列。NJ-Clade中感染者年龄显著低于其他流行枝(χ^(2)=34.286,P<0.001),并且具有更高比例的同性性向(χ^(2)=19.129,P=0.024)和男男性行为(χ^(2)=14.293,P=0.027)。71.82%(288/401)的CRF01_AE毒株形成83个传播网络。多因素分析显示,相比Clade 4a(a OR=0.464)、Clade 4b(a OR=0.363)、Clade 5(a OR=0.483)流行枝,NJ-Clade具有更高的网络形成率。结论 南京地区HIV-1 CRF01_AE毒株流行情况复杂,除包含全国相关流行枝外,已形成了独特的南京流行枝,应持续监测各流行枝的进化传播情况。

1996-2014年中国HIV-1毒株CRF01_AE亚型传播簇和传播网络研究

目的了解我国HIV-1毒株CRF01_AE亚型在省内和省际的传播规律和风险因素,为实施精准干预提供参考依据。方法收集我国19个省份1996-2014年已有的2094条CRF01_AEpol区基因序列,利用PhyML3.0软件构建系统进化树,确定传播簇,利用Cytoscape3.6.0软件构建传播网络,结合背景信息分析传播风险。结果发现82个传播簇,包含255条序列(12.18%,255/2094),省内传播簇数量和包含序列数(61个,173条)明显多于跨省传播簇(21个,82条)。传播簇中男男性传播人群的成簇比例随时间上升趋势明显,由1996-2008年的2.41%(2/83)上升为2013-2014年的23.61%(72/305)(χ^2=27.800,df=1,P=0.000)。跨省传播簇的男男性传播人群比例明显高于省内传播簇,由1996-2008年的0.67%(2/297)上升为2013-2014年的6.36%(30/472),具有随时间的上升趋势(χ^2=20.276,df=1,P=0.000)。跨省传播簇中男男性传播的比例(86.59%,71/82)明显高于省内传播簇(56.65%,98/173),差异有统计学意义(χ^2=22.792,P=0.000)。含2种及以上传播途径的跨省传播簇的比例(33.33%,7/21)明显高于省内传播簇(13.11%,8/61),差异有统计学意义(χ^2=4.273,P=0.039)。传播网络分析发现,跨省传播簇内高传播风险人群比例(51.22%,42/82)明显高于省内传播簇(26.59%,46/173),差异有统计学意义(χ^2=14.932,P=0.000)。跨省传播簇以男男性传播人群为主。结论我国HIV-1毒株CRF01_AE亚型存在复杂的传播网络,跨省传播簇快速增长,其中高风险传播者对HIV-1亚型的大范围传播起到重要作用,应深入进行传播网络研究以指导精准干预。

黑龙江省HIV-1型流行株CRE01_AE env基因序列特征和传播簇分析

目的分析黑龙江省HIV-1感染者中流行株CRF01_AE env基因序列特征以及成簇特性。方法应用巢式聚合酶链反应（Nested polymerase chain reaction ，Nested-PCR）对env C2-C4区核苷酸序列进行扩增。用MEGA软件进行系统进化分析，然后对156份CRF01_AE重组型HIV-1毒株env基因V3环及邻近区域氨基酸特征分析以及生物信息学分析。 结果156份样本中绝大多数样本与中国黑龙江、吉林、辽宁的代表毒株聚成一簇，还有一小部分样本与来自中国云南以及泰国代表株90CM240、90CM235聚成一簇。共发现6种V3环顶端四肽类型，主要类型为GPGQ、GPGR，此外还有GLGR、GQGR、GPGK、GPGS。根据V3环的氨基酸分析可预测HIV-1辅助受体的使用情况，其中121份（77.6%）使用趋化因子受体5（chemokine reseptor，CCR5）作为辅助受体，没有可被预测为使用趋化因子受体4[chemokine（c-x-c matif）-receptor 4，CXCR4]为辅助受体的毒株，35份（22.4%）样本不能被预测。以bootstrap≥90%、基因距离≤0.045作为界定传播簇的参数，共形成16条传播簇，其中1条传播簇有9条序列。结论黑龙江省HIV-1流行株CRF01_AE V3环顶端四肽具有较大的变异性，大部分毒株呈现巨噬细胞嗜性。CRF01_AE毒株形成的传播簇规模较小，成簇序列数也仅达到四分之一。

1例早期HIV感染者外周血抗体变化和病毒基因序列分析

目的:观察HIV早期感染者体内的抗体变化特征,为进一步研究HIV感染早期病毒与宿主的相互作用奠定基础。方法:对一名HIV感染者进行流行病学调查、外周血血清学检测、病毒载量和CD4细胞数检测、体外病毒分离,观察该感染者体内免疫学反应及病毒复制特点。使用巢式PCR方法扩增病毒env区C2-V3区基因,通过测序及序列分析观察病毒部分膜区基因特点。结果:该感染者为早期感染,外周血抗体S/CO值呈逐渐增高趋势,外周血中针对HIV抗原的特异性条带呈逐渐增多趋势,感染183 d后出现针对所有HIV抗原的特异性抗体,病毒载量在感染后3个月时最高(18 000 cp/ml),随后下降,从该感染者外周血中分离的病毒毒力较强。基因序列分析显示该病毒为CRF01_AE亚型,与泰国93TH054毒株基因距离最近。结论:该感染者体内病毒可能起源于泰国毒株,对HIV早期感染的鉴定为研究我国HIV早期感染者体内病毒进化奠定了基础。

广西防城港市HIV-1流行株env基因C2V3区序列特征及亚型分析

目的了解近期防城港市HIV-1流行毒株env基因C2V3区亚型及分布特征,为防城港市防治艾滋病工作提供科学依据。方法于2017年10月～2018年4月在防城港市人民医院收集199例定点随访的接受抗病毒治疗的HIV感染者或艾滋病病人(human immunodeficiency virus/acquired immunodeficiency syndrome,HIV/AIDS)的流行病学调查信息和10 ml外周血。从外周血白细胞中提取前病毒DNA,用巢式聚合酶链反应对获得的HIV-1前病毒DNA env C2V3区基因片段进行扩增,并进行DNA测序,获得的DNA序列信息使用Sequencher 5.1、MEGA 5.0软件进行清理和分析。结果本研究共收集199例HIV/AIDS,其人口学特征主要以年龄18～49岁为主,占53.70%;职业以农民和待业为主,分别占42.59%、45.37%;学历以初中及以下为主,占89.81%;民族以汉族为主,占75.93%;传播途径以异性传播为主,占93.52%。成功扩增HIV-1env C2V3区基因108例,其中CRF01_AE(Circulating Recombinant Forms,CRF)亚型103例,CRF BC亚型3例,B、CRF59_01B亚型各1例。发现8种gp120 V3环顶端四肽,其中以GPGQ为主,占50.00%;其次为GPGR和GPGK,分别占22.22%、12.96%。预测辅助受体为CXCR4(chemo-kine receptor 4) 59例,占54.63%;其次是CCR5辅助受体(chemo-kine receptor 5)30例,占27.78%;CXCR4/CCR5辅助受体19例,占17.59%。结论防城港市主要流行HIV-1 CRF01_AE亚型,其流行毒株亚型存在多态性。防城港市HIV-1型CRF01_AE毒株膜区V3环氨基酸顶端四肽存在较高的多态性,使用CXCR4辅助受体的HIV-1毒株比例高于用CCR5辅助受体的毒株。