抑制CRIF1基因促进L615白血病细胞体内增殖的动物实验初步研究

目的探讨CRIF1基因对L615白血病细胞小鼠体内增殖的影响。方法实验分为3组,CRIF1-RNAi L615实验组(n=3):慢病毒干扰载体抑制L615细胞CRIF1-GFP基因表达;空载体对照组(n=3):空载体转染L615细胞;空白对照组(L615细胞空白对照)(n=3);建立白血病小鼠模型。通过肝脾印片、骨髓涂片及外周血流式细胞仪检测观察各组小鼠体内L615细胞增殖情况,比较各组小鼠的外周血白细胞计数(WBC)、生活质量和生存时间、肝脾指数。结果流式细胞仪检测:CRIF1-RNAi L615实验组、空载体对照组的小鼠外周血均见大量GFP阳性L615细胞;肝、脾印片及骨髓涂片结果显示肝、脾、骨髓均被白血病细胞浸润,3组小鼠均成瘤。CRIF1-RNAi L615实验组、空载体对照组及L615对照组小鼠在白血病细胞植入d5后外周血WBC(×109/L)分别为:42.23±15.08 vs 17.10±4.10 vs 17.30±5.05(P<0.01);生存时间(d)分别为:6.33±1.15 vs 10.00 vs 8.33±2.89(P<0.01);CRIF1-RNAi L615实验组小鼠脱毛、弓背等并发症出现提前;肝、脾指数分别为:122.31±2.83、35.21±0.45 vs 110.89±13.30、21.54±3.40 vs 89.76±5.56、24.71±2.48(P<0.05)。结论抑制小鼠L615白血病细胞CRIF1基因表达后,明显著促进L615白血病细胞在小鼠体内增殖、浸润并加快移植小鼠发病死亡。

人CRIF1基因调控骨髓间充质干细胞细胞周期分布初步研究

目的探讨人CRIF1基因对骨髓间充质干细胞(hBMSCs)细胞周期调控机制。方法通过构建慢病毒载体改变CRIF1表达水平,合成发夹shRNA模板寡核苷酸链,构建pGreenPuro-sh-CRIF1干扰载体;PCR扩增CRIF1基因CDS全长,链接pMD18-T载体经测序鉴定后,构建pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP过表达载体。载体成功构建后包装慢病毒,并转染hBMSCs,以pLentis-CMV-SFFV-GTP空载体病毒作为对照,定量PCR及Western blot(WB)检测CRIF1基因和蛋白表达,流式细胞仪检测hBMSCs细胞周期分布,并通过免疫荧光观察CRIF1与CDK2细胞共定位。结果成功构建CRIF1 shRNA及过表达慢病毒载体,测定后病毒滴度达到108TU/mL。以MOI=10转染hBMSCs,并以0.8μg/mL嘌呤霉素筛选1周后,感染效率可达到>95%,WB及定量PCR证实,CRIF1基因和蛋白的表达水平,在pGreenPuro-sh-CRIF1载体转染后hBMSCs细胞受到抑制:与对照组比较,mRNA相对表达水平0.42±0.03 vs1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平0.13±0.024 vs 1.00±0.04(P<0.01),而pLentis-CMV-CRIF1-SFFV-GTP载体转染后得到增强:与对照组比较,mRNA相对表达水平5.54±0.53 vs 1.00±0.03(P<0.01),蛋白相对表达水平4.21±0.22 vs 1.00±0.04(P<0.01)。同时,CRIF1基因过表达诱导hBMSCs G0/G1期阻滞(与对照组比较,84.99±2.66 vs 77.28±0.86,P<0.01),抑制CRIF1基因表达促进其进入细胞周期循环:G0/G1期比例与对照组比较,61.60±3.02 vs 77.28±0.86(P<0.01)。激光共聚焦显示,CRIF1与CDK2共定位于胞浆与胞核。结论 CRIF1可能通过与CDK2结合,负性调控hBMSCs细胞周期分布。

CRIF1基因启动子克隆及活性分析

目的研究急性髓性白血病基因1(AML-1/RUNX1)调控CR6相互作用因子(CRIF1)基因启动子的主要活性区域。方法采用PCR技术克隆CRIF1基因启动子并测序,构建截短突变体,以双荧光素酶报告系统检测AML-1/RUNX1调节CRIF1基因启动子的主要活性区域。结果克隆出CRIF1基因启动子-2 505—+9共计2 514 bp的活性区域,并构建了截短突变体CRIF1-1 800、1 500、1 000、600及300 bp;较之CRIF1基因启动子全长序列转录活性,CRIF1-300 bp突变启动子活力明显下降,CRIF1-600 bp内启动子活力与其相当,CRIF1-1 500 bp区启动子活性是它的2.8倍。结论本研究提示CRIF1基因启动子-1 500—-2 514 bp间可能是AML-1/RUNX1对其进行转录负性调控的主要活性区域。

淫羊藿苷干预自然衰老模型大鼠大脑皮质趋化因子Fractalkine及其受体CX3CR1的表达

背景:趋化因子Fractalkine(FKN)不仅涉及到趋化、黏附和炎症反应,在脑组织中也参与神经细胞的增殖和凋亡。目的:观察淫羊藿苷对自然衰老大鼠大脑皮质趋化因子Fractalkine及其受体CX3CR1的影响。方法:选用3月龄雄性SD大鼠80只,随机分为4组:青年组、自然衰老组、淫羊藿苷低剂量组、淫羊藿苷高剂量组。淫羊藿苷组从16月龄开始分别灌胃淫羊藿苷30,60 mg/kg,连续60 d,青年组和自然衰老组灌胃等量生理盐水60d至取材前。采用苏木精-伊红染色法观察大鼠脑组织形态学变化;β-半乳糖苷酶染色测定脑组织衰老情况;免疫组织化学检测皮质趋化因子Fractalkine和CX3CR1的表达;酶联免疫吸附法检测脑组织中白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平;免疫印迹检测脑组织Caspase-3蛋白表达,比色法检测Caspase-3活性。结果与结论:(1)自然衰老组趋化因子Fractalkine表达明显低于青年组,CX3CR1表达、Caspase-3表达及活性、SA-β-gal阳性颗粒数、炎性指标白细胞介素6、肿瘤坏死因子α明显高于青年组;而淫羊藿苷用药后能逆转上述现象,且淫羊藿苷高剂量组好于淫羊藿苷低剂量组;(2)结果提示淫羊藿苷能够低脑组织中的炎性因子水平,抑制神经细胞凋亡,可能与影响趋化因子Fractalkine及CX3CR1表达有关。

趋化因子在肝纤维化中作用的研究进展

目前，已发现50多种趋化因子（chemokine）[1,2]。根据其基因组成和N-端2个高度保守半胱氨酸残端位置不同，趋化因子分为CXC亚家族（chemokine CXC subfamily）、CC亚家族（chemokine CC subfamily）、C亚家族（chemokine Csubfamily）、CX3C亚家族（chemokine CX3C subfamily）。 趋化因子受体（chemokine receptor）属G蛋白偶联受体超家族。目前共发现19种配体[1,2]，根据其对应的配体进行分类，分为1个CX3CR1、1个 XCR1、6个CXC受体（CXCR1～CXCR6）及11个CC受体（CCR1～CCR11）。

As3MT、N6AMT1基因-环境交互作用对砷暴露所致皮肤损伤影响

目的探讨砷甲基转移酶(As3MT)和N-6-腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1(N6AMT1)基因多态性及基因-环境交互作用与砷暴露所致皮肤损伤(AISL)的关联性。方法于2010年9月到2011年12月在内蒙古五原县入选饮水型砷暴露人群335人,65例被确诊患有AISL。应用MassARRAY^(?)分子量阵列平台检测基因型,高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用法测定尿砷代谢物,砷暴露时间由其高砷水饮用时间确定,多因子降维法与岭回归模型分析基因型、环境因素的单独效应及基因-环境的交互作用。结果 As3MT基因rs3740400位点CA/AA基因型、N6AMT1基因rs 1006903位点GC/CC基因型和尿二甲基胂酸(DMA)升高为AISL的独立危险因素(P<0.05)。rs3740400位点基因型-尿无机砷(iAs)-单甲基胂酸(MMA)的交互作用与AISL发生风险间存在显著的统计学关联(OR=0.62, 95%CI=0.41～0.94,P=0.024),模型的验证样本准确率为0.577 6,交叉验证一致性为9/10。结论 As3MT、N6AMT1基因多态性及尿砷化合物水平均与AISL独立相关,rs3740400位点基因型、尿iAs和MMA的交互作用在慢性砷中毒的发生发展中具有重要作用。