应用CRISPR/Cas 9系统构建肺癌细胞系获得AMPKα1基因敲除的稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas 9系统在人肺癌细胞系A549和H460中获得敲除腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1(adenosine monphosphate-activated protein kinase,AMPKα1)的稳定表达细胞系。方法根据CRISPR/Cas 9靶点设计原则,设计三条引导RNA(sgRNA),分别构建AMPKα1-CRISPR/Cas9 KO及其HDR质粒。将质粒转染至A549和H460细胞后,筛选稳定的单克隆细胞株。用Western blot鉴定筛选获得的肺癌细胞株是否表达AMPKα1。实验被分为原始对照组和敲除组,采用MTT法检测AMPKα1的肺癌细胞增殖情况。结果经过CRISPR/Cas 9系统处理后,筛选获得的A549和H460敲除AMPKα1稳定细胞株与原始细胞株A549和H460相比,Western blot检测不到AMPKα1蛋白质的表达,差异具有统计学意义(t=137.7,79.17,均P<0.0001)。MTT结果显示,筛选获得的A549和H460敲除AMPKα1的稳定细胞株与原始细胞株A549和H460相比,敲除细胞株的增殖速度明显减弱,差异具有统计学意义(t=3.956~28.16,均P<0.05)。结论CRISPR/Cas 9系统成功建立敲除AMPKα1表达的稳定肺癌细胞株,为进一步研究AMPKα1在肺癌发生发展中的作用提供细胞模型。

茶炭疽菌中CRISPR/Cas 9敲除系统构建

【目的】以调控茶树炭疽病菌(Colletotrichum camelliae)中的植物真菌毒素(Solanapyrones)合成的CcSOL4为例,构建CRISPR-Cas9的基因敲除载体系统,为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶炭疽菌中的应用奠定基础。【方法】通过对转录因子CcSOL4的基因序列分析,选择5个靶点以PCBC载体为模板扩增目的片段,再与表达载体PKSE401发生重组构建基因标记载体。以携带Cas9编码基因的PKSE401双元双靶点载体系统为骨架,以PCBC载体为模板扩增相应的sgRNA,运用Overlapping PCR以及Golden Gate Cloning技术构建针对炭疽病的双靶点和三靶点CRISPR/Cas9编辑载体。【结果】双靶点载体片段及三靶点载体片段扩增后大小为650~750 bp,将上述PCR片段连入载体PKSE401,双靶点载体1Sol4和2Sol4经阳性鉴定得到650 bp片段,三靶点载体3Sol4经阳性鉴定后得到1200 bp的片段。【结论】重组载体构建成功,并建立了茶炭疽菌C.camelliae的CRISPR/Cas9敲除体系。

CRISPR/Cas 9基因编辑技术降低贵州禾株高研究

为获得株高降低的贵州禾水稻新种质,以贵州禾高秆糯稻材料黎平杂边禾为研究材料,根据CRISPR/Cas 9靶位点设计原则设计水稻OsGA20ox2基因的特异性靶点sgRNA序列,构建水稻OsGA20ox2基因的CRISPR/Cas 9定点突变载体,利用农杆菌介导的愈伤转化法遗传转化黎平杂边禾,通过潮霉素筛选,以及PCR分子检测,获得16株转基因植株。对筛选获得的转基因植株基因进行测序,获得7株OsGA20ox2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。研究表明,T 1代突变体植株株高比黎平杂边禾降低了29.6%。

利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术提高贵州禾产量研究

以贵州禾糯稻黎平杂边禾为研究材料,设计水稻产量控制关键基因OsCKX2的CRISPR/Cas 9编辑特异性靶点序列,构建水稻OsCKX2基因的CRISPR/Cas 9定点编辑载体,并利用农杆菌介导法导入黎平杂边禾,通过潮霉素筛选及PCR分子检测,获得20个独立的转基因植株。对筛选获得的转基因T0代植株基因进行测序比对,获得7株OsCKX2基因靶位点被编辑的突变转基因植株。对纯合的突变体T1代植株农艺性状进行分析发现,与野生型黎平杂边禾相比,突变体的穗粒数增加16.67%,单株产量增加25.03%。本研究获得了产量增加的黎平杂边禾基因编辑的新种质。

利用CRISPR/Cas 9编辑红曲霉pyrG基因对其次生代谢的影响

为研究红曲霉pyrG基因对其次生代谢的影响,通过农杆菌介导遗传转化获得了转Cas 9基因的红曲霉底盘菌株,然后设计并体外转录合成pyrG基因的定向编辑sgRNA,对底盘菌株的原生质体遗传转化,经5-FOA抗性筛选、PCR扩增、T7EI酶切和测序验证,获得pyrG基因定向编辑的红曲霉4个菌株,其中2株单碱基缺失,2株2碱基缺失。比较分析表明,野生型红曲霉在添加尿嘧啶核苷的培养基中会极显著增加洛伐他汀含量,并极显著降低桔霉素含量,而经CRISPR/Cas 9失活pyrG的变异菌株与野生型相比,洛伐他汀和桔霉素含量明显增加。表明尿嘧啶核苷合成关键酶基因pyrG和外源尿嘧啶核苷对红曲霉的次生代谢有协同调控作用,为红曲霉功能基因研究和次生代谢调控提供参考。

利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统,并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体;随后人工设计同源修复供体基因序列,并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中,构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系;将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中,PCR鉴定筛选到的阳性菌株,并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确,表明载体构建成功;PCR鉴定结果显示,该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除,敲除效率为46%~58%;测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统,为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

目的利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质Gla蛋白(MGP)基因敲除的RAW264.7巨噬细胞系,明确MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出3个针对MGP基因外显子区的单链向导RNA(gRNA),人工合成gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的LentiCRISPRv2质粒中,构建成LentiCRISPRv2 MGP gRNA重组质粒。将重组质粒与psPAX2、VSVG包装质粒一同转染293 T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证MGP mRNA及蛋白表达水平。qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了LentiCRISPRv2 MGP gRNA重组质粒,成功包装了含有MGP gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达MGP的RAW264.7细胞系。qPCR及蛋白质印迹法检测显示,其MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P<0.05)。qPCR结果显示,最具有代表性的LentiCRISPRv2 MGP gRNA1细胞破骨标志分子Itgb3(2.29±0.17)、Acp5(2.86±0.15)、Ctsk(2.07±0.13)的mRNA水平均显著上调(P<0.05)。结论利用CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了MGP基因敲除的RAW264.7细胞系,敲除MGP后RAW264.7细胞破骨分化能力增强。

利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体

培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

利用CRISPR/Cas9构建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因对心脏功能的影响

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A)基因敲除小鼠,从分子水平及组织水平上研究PPP2R3A缺失对心脏的影响。方法 将Cas9 mRNA和两个靶向PPP2R3A第3外显子翻译起始密码子附近区域的单导向RNA微注射到C57BL/6小鼠受精卵中。小鼠出生后取其基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)和测序以鉴定基因型,鉴定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠为KO组,野生型C57BL/6小鼠为WT组(雄性3只,雌性2只)。小鼠心脏组织经甲醛固定并制成切片后分别进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。提取小鼠心脏组织总RNA和蛋白,应用荧光定量PCR和Western印迹验证基因敲除小鼠的有效性和检测互作蛋白表达。结果 获得F1代PPP2R3A杂合小鼠,PCR和测序结果表明突变小鼠的基因型存在113 bp的缺失突变。与WT组相比,KO组心脏组织中PPP2R3A mRNA和蛋白表达量明显下降(均P<0.05),参与心脏发育的G蛋白信号转导调控因子(RGS)19表达量明显升高(P<0.05)。PPP2R3A蛋白表达受损引起了心脏组织病理学变化。结论 PPP2R3A在体内可能通过与RGS19蛋白互作来参与心脏的发育并对心脏功能产生影响。

CRISPR/Cas9技术在热带作物育种中的应用研究进展

在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考。

基于CRISPR/Cas9的棉花GhbHLH71基因编辑突变体的分析

碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,bHLH)转录因子在植物的生长发育、次生代谢、信号转导、逆境胁迫等方面起重要的调控作用。棉花GhbHLH71基因c DNA全长996 bp,编码331个氨基酸残基,蛋白序列中含有保守的bHLH结构域,属于bHLH转录因子家族成员。实时荧光定量分析结果表明,GhbHLH71基因在棉花纤维快速伸长期3~12 DPA (days post anthesis,DPA)相对高表达,暗示其主要在棉花纤维发育过程中发挥作用。构建该基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行了棉花遗传转化,T_0代再生株经过Cas9基因的PCR检测以及靶位点突变情况检测分析,获得6个T_0代基因编辑突变体。T_1代不同突变株系在棉花生长发育期的表型性状与对照相比无明显差异,但成熟纤维的长度与对照相比皆明显变短。T_2代突变株系可以稳定遗传T_1代株系纤维变短的表型。其中4#和8#株系连续2代的纤维长度与对照相比缩短比率皆达20%以上,表明GhbHLH71基因的突变主要影响了棉花纤维细胞的伸长。本研究为深入了解棉花中bHLH转录因子的生物学功能以及棉花纤维发育的分子机制提供了一定的参考。

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子胚胎表现出不同程度的心腔膨大、环化异常及心管线性化等畸形现象。综上可知,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼prkd1基因敲除品系,为进一步研究该基因在人类心脏发育中的特异性功能提供了有益参考,并为后期的先天性心脏病筛查和精准医疗提供了重要依据。

利用CRISPR/Cas9技术编辑GmBADH1基因改变大豆耐盐性

耐盐基因功能鉴定对于大豆品种改良以及盐碱地的开发利用至关重要。盐害胁迫下作物通过合成和积累甜菜碱作为渗透保护剂,减小盐害对作物产量的影响。BADH基因已在多种植物中被证实调节植物对逆境胁迫的响应,但在大豆中的调控机制尚不清晰。本研究克隆了GmBADH1基因,qRT-PCR显示该基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达丰度最高。通过农杆菌介导的大豆遗传转化技术将CRISPR/Cas9系统构建的表达载体转入到大豆品种JACK中,产生了3种可以调控大豆耐盐性状的靶向突变,均发生在编码区,分别为缺失19 bp、插入1 bp、插入9bp替换2 bp。前两者,过早出现的终止密码子,使其均产生截断的BADH1蛋白,后者发生移码突变。在出苗期和苗期分别对突变纯合植株进行盐处理,结果表明,出苗期耐盐性与野生型相比显著下降,苗期与野生型相比无明显差异。这说明GmBADH1基因可能主要调控出苗期的耐盐性状。本研究为深入挖掘大豆耐盐基因和培育大豆耐盐品种提供了依据。

利用CRISPR/Cas9技术构建Quaking敲除的小鼠胚胎成纤维细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9技术构建小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,并检测Quaking基因对NIH3T3细胞增殖能力的影响。【方法】首先,利用在线网站设计两条靶向作用于Quaking外显子的sgRNA,成功构建了两个分别靶向Quaking基因第1、第2外显子的CRISPR/Cas9重组慢病毒质粒。将构建的Quaking基因CRISPR/Cas9重组慢病毒载体和pcDNA3.1-Quaking过表达质粒共转染至HEK293T细胞中,通过Western blot实验检测Quaking蛋白的敲除效率。其次,将筛选得到的敲除效率高的重组慢病毒质粒(LentiCRISPRv2-sgRNA1)与辅助包装质粒共转染入HEK293T细胞进行慢病毒包装,慢病毒转导NIH3T3细胞后,利用嘌呤霉素筛选阳性单克隆细胞株。最后,通过Western blot及免疫荧光染色鉴定敲除效果。【结果】发现Quaking蛋白在该细胞株中不表达,并测序证实了发生片段敲除。CCK8检测发现,Quaking基因敲除显著抑制了NIH3T3细胞的增殖能力。【结论】本研究首次通过CRISPR/Cas9技术成功构建了小鼠胚胎成纤维细胞(NIH3T3)Quaking基因敲除细胞株,为后续研究Quaking基因在小鼠生理功能调节中的作用机制提供了体外模型基础。

CRISPR/Cas9系统在畜禽遗传改良中研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种高效的基因组编辑方法,在畜牧业遗传改良领域得到了广泛的应用。该技术以高效、精准的特点,为畜牧业发展带来了一场革命。目前,基于CRISPR/Cas9的基因敲除、基因敲入和基因修饰等已被广泛应用,实现了对畜禽物种的重要生产性状进行精准改良。本文介绍了CRISPR/Cas9技术的工作原理及发展历程,重点介绍了该技术在畜禽肌肉生长发育、绒毛纤维生长、乳品质成分、抗病育种以及动物福利中的研究进展,旨在为更深入地了解CRISPR/Cas9技术在畜禽基因编辑上的应用提供参考。

基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析

【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4(Krüppel-like factor 4,KLF4)基因敲除的猪小肠上皮细胞,并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs(sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3),经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接,产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定,并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。PCR扩增敲除位点附近序列,并通过测序判断sgRNA敲除效率;利用CruiserTMEnzyme酶切鉴定阳性细胞克隆,通过TA克隆测序鉴定敲除序列;利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示,sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现,3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除,其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTMEnzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现,KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明,KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示,敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性(P<0.01),并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞,且KLF4基因敲除可抑制细胞活性,并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。

CRISPR/Cas9技术高效制备山羊SOCS2基因编辑胚胎

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas 9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

CRISPR/Cas9介导的adeG基因敲除大肠杆菌细菌模型的建立

【目的】鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是引起医院内感染的重要条件致病菌之一,耐药性AB是目前防治的棘手问题。细菌外排泵是引起耐药性的重要原因之一,拟通过PCR检测鲍曼不动杆菌耐药结节分化家族(resistance-nodulation-division,RND)外排泵基因adeLFGH的分布,探索其与耐药性的关系;建立adeG耐药基因模型,利用CRISPR/Cas9系统对其进行靶向敲除的初步研究。【方法】运用肉汤微量稀释法检测耐药性分布;PCR筛查13株临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH外排泵基因并分析其分布;扩增RND外排泵关键基因adeG并构建耐药细菌模型;设计特异性sgRNA,利用CRISPR/Cas9系统进行靶向敲除,药敏实验检测其敲除效果。【结果】13株临床鲍曼不动杆菌对多黏菌素E敏感,对左氧氟沙星耐药率较低,仅为38.5%,对头孢他啶的耐药率为92.3%,对妥布霉素耐药率为84.6%,对其他临床常见药物耐药率均为100%。13株多重耐药鲍曼不动杆菌adeLFGH携带率为100%。药敏实验结果显示adeG模型耐药菌株的哌拉西林、替卡西林/克拉维酸以及哌拉西林/他唑巴坦由敏感转为耐药,氯霉素、美罗培南、米诺环素由敏感转为中介。特异性sgRNA介导CRISPR/Cas9系统靶向敲除效率不同。pCas9-sgRNA1(adeG)靶向后哌拉西林/他唑巴坦的耐药性得到了逆转,对妥布霉素、四环素、多西环素、米诺环素的耐药性也有不同程度的降低;pCas9-sgRNA2(adeG)和pCas9-sgRNA3(adeG)使哌拉西林/他唑巴坦由耐药恢复到了中介,但对其他药物的耐药性逆转效果并不显著。【结论】特异性CRISPR/Cas9系统可以特异性敲除耐药基因,提示可为耐药菌的治疗提供新的思路和方法。

基于CRISPR/Cas9技术构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株及其表型研究

目的 采用CRISPR/Cas9技术构建吲哚胺-2,3-双加氧酶1(IDO1)基因敲除的THP-1细胞株,为研究IDO1在巨噬细胞中的作用提供细胞模型。方法 设计靶向IDO1基因的3条向导RNA(guide RNA,gRNA),分别构建IDO1-gRNA重组质粒,酶切及测序鉴定后,包装成Lenti-IDO1-gRNA慢病毒。利用Cas9慢病毒感染THP-1细胞获得稳定表达Cas9蛋白的细胞株,再经Lenti-IDO1-gRNA慢病毒感染敲除IDO1基因,有限稀释法获得单克隆细胞株。T7E1酶切检测gRNA打靶效率,PCR产物测序和Western blot鉴定IDO1基因敲除效果。CCK8法检测IDO1基因敲除对THP-1细胞增殖活性的影响,流式细胞术检测对巨噬细胞标志物CD11b、CD68和CD14表达的影响,中性红法检测巨噬细胞吞噬功能。结果 成功构建了3种IDO1-gRNA重组质粒,3条gRNA均能有效编辑IDO1基因,以gRNA2编辑效率最高。经PCR产物测序和Western blot验证获得了3株THP-1 IDO1-KO单克隆细胞株,并发现IDO1基因敲除可抑制THP-1细胞增殖,下调THP-1巨噬细胞CD11b、CD68表达,上调CD14表达,增强THP-1巨噬细胞吞噬功能。结论 成功构建IDO1基因敲除的THP-1细胞株;IDO1对THP-1细胞增殖活性、分化调节以及THP-1巨噬细胞吞噬功能调节有重要作用,为后续进一步探讨IDO1基因在巨噬细胞中的功能及机制研究奠定基础。

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建ACTA1基因敲除的PEFs细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术获得α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts, PEFs),为后续在细胞水平上探究猪ACTA1基因功能及发掘友好基因座位奠定基础。【方法】通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮下脂肪和背最长肌7种组织中的表达情况;利用CRISPOR在线网站在猪ACTA1基因第7外显子区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX330载体;通过T7E1酶切检测不同sgRNA活性,选择效率较高且符合目标的载体质粒共转染至PEFs中;利用有限稀释法筛选单克隆细胞,并对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定和脱靶分析。【结果】实时荧光定量PCR结果表明,ACTA1基因在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。设计的3条sgRNA的基因编辑效率分别为24.87%(sgRNA1)、39.59%(sgRNA2)、36.93%(sgRNA3),综合切割位置和基因编辑效率,选用sgRNA1和sgRNA2共转染细胞。基因型鉴定结果表明,获得的69株单克隆细胞中有20株单克隆细胞发生了编辑,其中单等位基因片段敲除细胞3株,双等位基因片段敲除细胞1株,片段敲除效率为5.8%(4/69)。脱靶分析结果显示,在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了ACTA1基因纯合敲除的PEFs,研究结果为进一步探究ACTA1基因对猪骨骼肌发育调控提供了技术支撑和理论基础,同时为挖掘猪组织特异性表达的友好位点提供新思路。