基于CRISPR/Cas12a系统的新型创伤弧菌试纸条检测方法的建立

创伤弧菌(VV)是一种重要的人畜共患和水生动物病原体,能引起人类和水生动物的弧菌病,严重影响人身健康和水产养殖业发展。快速、灵敏、准确的VV检测方法对于保障人民生命健康、降低水产养殖业损失至关重要。为建立一种新型VV检测方法,基于重组酶辅助扩增(RAA)技术和基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a)系统,构建了一种通过试纸条(LFS)读取VV检测结果的方法RAA-CRISPR/Cas12a-LFS。该方法不依赖精密仪器,通过肉眼读取LFS结果便可快速、灵敏、准确检测VV,检测限为10 copies/μL VV基因组DNA,检测时间约为60 min。此外,该方法具有高特异性,并可准确检出血液、粪便、虾类等加标样品中的VV。因此,所构建的VV检测方法RAA-CRISPR/Cas12a-LFS兼具简便、快速、灵敏、准确的特性,有望用于弧菌病早期诊断以及水产品VV感染/污染情况的现场检测。

基于CRISPR/Cas12a系统的比色检测方法探究

基于Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas12a(CRISPR/Cas12a)系统的特征基因识别检测技术,已经可以实现DNA的普适性检测。同时,基于CRISPR/Cas12a系统的反式酶切活性,可以降解(有目标DNA)或者不降解(无目标DNA)检测体系中添加的指示探针,设计一对通用的DNA纳米金探针进行裸眼可视化DNA比色检测。整个检测过程与结果读出不依赖于实时定量荧光PCR仪、恒温培养箱等大型仪器,整个流程可以在1小时之内完成。

水稻CRISPR/Cas12a系统的优化及其介导的腺嘌呤碱基编辑器的建立

为了构建高效的CRISPR/Cas12a介导的水稻基因编辑系统,通过测试不同来源的Cas12a蛋白、crRNA长度和构型来探索影响Cas12a编辑活性的因素发现,相对于AsCas12a和LbCas12a在crRNA为23 nt时具有更高的编辑效率,并且crRNA 3'端的U_(4)AU_(4)结构并不能增强其在水稻中的编辑活性,同时利用大肠杆菌腺嘌呤脱氨酶变体TadA8e开发了CRISPR/LbCas12a介导的腺嘌呤碱基编辑系统pUbi∶rBE58,成功地将水稻内源基因OsCPK15实现A到G替换(A>G),其效率为33.33%。本研究证明了利用CRISPR/Cas12a可以对水稻基因组进行编辑,丰富了水稻基因编辑工具,拓宽了基因编辑工具箱。

NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立

近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。

CRISPR/Cas系统在核酸检测中的应用和挑战

成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关基因(Cas)系统是古菌和细菌适应性免疫系统,最初被发现用来进行基因编辑,近年其特异识别和切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标检测中崭露头角。目前基于CRISPR/Cas系统的核酸检测系统主要与核酸扩增技术如PCR、链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)和EXPAR等恒温扩增技术结合,以提高灵敏度;多项研究也在尝试开发基于CRISPR/Cas的无预扩增核酸检测系统;另外也有研究尝试通过生物祖体(包括适体、DNAzymes和抗原-抗体反应)特异性识别靶物质实现非核酸信号转换为核酸信号,实现基于CRISPR/Cas的蛋白质、小分子、细胞等非核酸物质的检测。但仍存在一些挑战,其中目标中痕量原始浓度的信号转换和放大是分析系统的关键挑战;其他挑战包括CRISPR/Cas存在一定背景活性,CRISPR RNA和单链DNA/单链RNA信号报告序列有降解风险等。随着技术的逐渐成熟,CRISPR/Cas系统将在生物靶标检测中发挥更大作用。本文就CRISPR/Cas系统在核酸检测这一领域的最新发展方向作一述评。

基于CRISPR/Cas12a的叶酸代谢位点MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立

目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略;测试200例孕妇人群样本MTHFR基因C677T多态性,并与常规PCR产物测序结果进行一致率比较。结果基于CRISPR/Cas12a检测人MTHFR基因C677T多态性的检测方法结果准确、特异性好,与PCR产物测序结果具有高度一致性。结论建立的基于CRISPR/Cas12a检测技术的人MTHFR C677T基因分型方法简单、快捷、精准,为叶酸代谢位点MTHFR C677T基因型检测提供了新的途径,具有潜在的临床应用前景。

基于RPA-CRISPR/Cas12a的美国白蛾可视化快速检测新方法

美国白蛾Hyphantria cunea Drury是我国重要林业害虫,寄主植物众多且分布范围广泛。本试验基于重组酶聚合酶扩增(RPA)和CRISPR检测技术,构建美国白蛾RPA-CRISPR/Cas12a分子检测体系。根据NCBI数据库中的美国白蛾及近缘种、近似种线粒体COⅠ基因片段信息以及昆虫样本CO I基因测序比对结果为模板,设计美国白蛾特异性RPA引物和CrRNA,通过RPA扩增目标序列,结合CRISPR检测技术并对反应条件进行优化,最终该体系灵敏度可检测的最低限度1.0×10^(-1) ng/μL,较RPA结合普通凝胶电泳提高了100倍,检测体系在30 min内即可实现对害虫的现场快速、可视化、精准鉴定。为美国白蛾现场检测提供理论和实践依据,有助于保护森林资源和生态环境的安全。

CRISPR-Cas系统在病原核酸检测中的研究进展

CRISPR-Cas系统作为原核生物获得性免疫系统,由簇状规则间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins,Cas)构成,因其识别和切割特定DNA或RNA序列,而成为分子诊断领域研究的热点。研究人员利用Cas蛋白(Cas12、Cas13、Cas14、Cas3等)结合信号放大和转化技术(荧光法、电位法、比色法、侧向流动技术等),开发了许多高灵敏度、高特异性、低成本的诊断平台,为病原核酸检测提供了新途径。本文介绍了CRISPR-Cas系统的生物学机制及分类,总结现有的基于Cas蛋白反式切割活性开发的病原核酸检测技术,描述其特点、功能和应用场景,并对该系统的未来应用前景进行展望,期望CRISPR-Cas系统成为包括核酸检测在内的多靶标的理想检测平台。

CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用

CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。

CRISPR/Cas系统中工程化gRNA技术的研究和应用

CRISPR/Cas是原核生物在进化过程中获得的一种免疫防御系统,用于抵抗外来遗传物质的入侵,近年来被开发成为高效的基因编辑、基因调控以及分子诊断工具。其可编程靶向机制揭开了利用该系统进行基因组操作的序幕,并允许在活性范围内实现动态调节和控制基因表达。作为现有基因修饰手段中灵活性最强和成本最低的技术之一,已被广泛应用于临床疾病治疗、工农业生产、可持续染料开发和化学品加工等领域。随着对CRISPR/Cas系统的不断深入挖掘和探索,大量研究报道了gRNA工程改造及优化方法,包括改变间隔序列长度、调节恒定区和可变区的结构、向末端或中间延伸添加额外功能序列及化学合成修饰等,以期降低脱靶突变率,提高作用效率,充分激发CRISPR基因操纵工具在生物医学方面的潜力。基于此,本综述将介绍CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12系统中gRNA工程化设计方法及应用研究的最新进展,分析探讨了当前工程化gRNA技术面临的机遇和挑战,旨在为获得性能更加优异的gRNA提供思路和方向,从而提高利用CRISPR/Cas系统探测人类细胞基因组的能力,进一步为可编程生物学带来更多可能性。

RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价

目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA引物和CRISPR来源RNA(crRNA),优化检测体系中乙酸镁(MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以100~106 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37℃条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1×102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2,与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。

基于CRISPR Cas12a的等温核酸检测技术用于新型隐球菌高敏诊断的临床研究

目的:构建基于CRISPR Cas12a的高敏等温核酸检测方法,并评估其在支气管肺泡灌洗液及脑脊液中对于新型隐球菌的诊断能力。方法:利用NCBI Blast确定新型隐球菌保守序列,针对保守序列,设计等温重组酶聚合酶扩增引物及crRNA序列。利用新型隐球菌标准菌株及其他菌株(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌),提取其核酸,以评估方法的特异性及最低检测限。进一步收集临床确诊的10例肺部及10例中枢神经系统新型隐球菌感染患者的支气管肺泡灌洗液及脑脊液,以评估本研究构建的核酸诊断方法的临床检测性能。结果:共设计6组引物及crRNA组合,经筛选得到1组最佳组合。本研究构建的检测方法特异性高(与7种其他类型菌株无交叉反应),最低检测限达到5 copies/μL,整个检测流程速度快(在1 h内完成)。针对10例支气管肺泡灌洗液及10例脑脊液临床标本的阳性检出率均为100%。结论:本研究构建的新型核酸检测方法,具有高度的特异性和良好的检测限,在临床标本检测中同样具有优良检测性能,具备了较强的临床新型隐球菌核酸检测的应用潜力。

基于RPA-CRISPR/Cas12a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立

番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因。通过优化反应体系建立了ToMV的快速可视化检测方法,当荧光报告基因FQ终浓度为400 nmol/L、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)/1000 nmol·L^(-1)时检测信号最强,只需RPA和CRISPR/Cas12a分别反应15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测ToMV,对携带ToMV样品的RNA检测灵敏度可以达到172 ag/μL,是普通RT-PCR检测灵敏度的10000倍,可用于ToMV快速灵敏的可视化检测。

鼠伤寒沙门氏菌CRISPR/Cas12a检测方法的建立与应用

目的建立快速、超灵敏检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法根据鼠伤寒沙门氏菌fliC基因保守片段设计并合成特异性CRISPR RNA(crRNA),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物,利用RPA技术扩增样本核酸,并对扩增产物进行CRISPR/Cas12a荧光检测。结果该检测方法克服了传统鼠伤寒沙门氏菌检测方法的缺陷,耗时短且具有较高的灵敏度,对鼠伤寒沙门氏菌的检出限低至1copy/μL,与乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌等常见食源性致病菌核酸检测无交叉反应,且建立的方法在检测人工污染的食品样品时具有较高的灵敏度和准确性。结论本研究建立的检测方法耗时短、灵敏度高,可用于鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。

基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒快速检测方法的建立

[目的]本研究将CRISPR/Cas12a系统与反转录重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)结合,拟建立一种基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)快速检测方法。[方法]分析不同基因型PRRSV全基因组序列,在3′-UTR端保守区设计重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)引物、crRNA及DNA报告底物分子,筛选RT-RAA最佳引物对。表达纯化AsCas12a蛋白,并以质粒为标准品,经RT-RAA扩增后,将产物加入CRISPR/Cas12a系统,建立PRRSV的CRISPR/Cas12a-RT-RAA检测方法,分别以PRRSV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸为模板验证建立方法的特异性,以不同浓度的pMD18T-PRRSV为模板验证建立方法的敏感性。以5.62×10^(6)、5.62×10^(3)、5.62拷贝数/μL的质粒为模板进行重复性试验,最后进行临床效果评价,将所建立的方法与实时荧光定量逆转录PCR方法进行比较。[结果]本研究成功表达并纯化获得具有良好剪切活性的AsCas12a蛋白,蛋白分子质量大小为196 ku;所建立的CRISPR/Cas12a-RT-RAA方法的检测下限可达5.62拷贝/μL;该方法具有良好的特异性,可特异性检测出PRRSV,不能检出其他猪病病毒PCV2、PEDV、CSFV和PRV,并具有良好的重复性。应用该方法对121份猪组织样品进行检测,与实时荧光定量逆转录PCR的阳性符合率为93.75%,阴性符合率为99.05%,总符合率为99.17%。[结论]本研究成功建立基于CRISPR/Cas12a-RT-RAA的PRRSV快速检测方法,该方法特异性强、灵敏性高、重复性好且不依赖复杂设备,可在现场和基层实验室使用。

基于AIEgens增强的CRISPR/Cas12a荧光探针设计及在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用

研制了一种基于聚集诱导发光染料(aggregation-induced emission fluorogens,AIEgens)增强的荧光探针,建立了基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合CRISPR/Cas12a高灵敏检测单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的新方法。利用阳离子AIEgens与双链DNA结合荧光极大增强的特性,构建了一种含双链以及单链DNA的探针。该探针5’末端携带一个荧光淬灭基团,双链DNA片段结合了多个AIEgens;利用crRNA可准确识别靶标序列并激活Cas12a反式切割活性的特点,切割荧光探针单链DNA产生荧光信号,从而实现LM高灵敏检测。将AIEgens增强型荧光探针与CRISPR/Cas12a结合,在无扩增情况下检测DNA片段的检出限为0.37 pmol·L^(-1),灵敏度较传统荧光探针高40倍。将以上检测体系与RPA反应联用,检测LM的检出限为3×10^(1) CFU·mL^(-1);该方法检测人工污染LM的牛奶以及金针菇样本,批内以及批间平均回收率介于91.14%~108.47%,变异系数小于12.71%。构建了一种基于AIEgens增强的CRISPR/Cas荧光探针,极大地提高了基于荧光信号输出的CRISPR/Cas方法检测灵敏度,实现了食源性致病菌的高灵敏检测。

基于CRISPR/Cas12a的生物传感平台的机制研究及应用

CRISPR/Cas12a系统能够由可编程的RNA引导,准确识别特异的单链DNA或含有PAM序列的双链DNA,而后在目标底物进行切割的同时完成对非特异性单链DNA的迅速切割,该特性使其在生物传感应用中显示出巨大前景。近年来,CRISPR/Cas12a系统被广泛应用于生物标志物的辅助检测,其生物标志物传感平台已在可视化细胞途径、体内活体诊断等生物分子传感器的构建方面得到应用。本文基于CRISPR/Cas12a生物传感平台的构建原理,对不同应用情景下CRISPR/Cas12a系统的变体进行了总结,并对基于该系统的体外、体内传感平台的应用进行了重点介绍和归纳,进一步讨论了不同传感平台的特点。最后对目前应用的优点和局限性做出总结和展望,以期为该领域的研究与应用提供一定参考。

基于CRISPR/Cas9系统构建裸鼹鼠HIF-1α基因敲除质粒及其功能验证

目的利用簇状规则间隔回文重复序列(CRISPR)/Cas9基因编辑系统构建质粒并敲除裸鼹鼠皮肤成纤维(NMR skin fibroblasts,NSF)细胞HIF-1α基因,为研究裸鼹鼠的耐低氧机制及缺氧相关疾病的发生发展机制提供体外细胞模型。方法针对裸鼹鼠HIF-1α基因的1~4号外显子区域设计4对sgRNA序列,并成功构建表达质粒。筛选得到最优sgRNA后,转染HEK-293T细胞收集上清液测定病毒滴度。前期用pLenti-Cas9(blast)病毒感染NSF细胞,后用制备的HIF-1α-sgRNA病毒感染表达Cas9蛋白的NSF细胞。经药筛后观察荧光表达,同时提取细胞gDNA和蛋白。通过T7E1酶和Western Blot检测NSF细胞中HIF-1α基因变化及蛋白表达情况。结果Sanger测序显示,所设计的sgRNA成功插入到pX459和pKLV2-U6-sgRNA2载体上,序列验证正确,重组质粒构建成功;T7E1酶切实验成功切除3条带,sgRNA的打靶效率为54%,Western Blot结果表明,经药筛后的裸鼹鼠NSF细胞HIF-1α基因敲除成功,蛋白水平显著降低(P=0.0019);且未发现HIF-1α敲除细胞形态的明显变化,基因敲除对细胞增殖能力无明显影响。结论成功构建靶向裸鼹鼠HIF-1α基因的CRISPR/Cas9质粒,且质粒靶向敲除HIF-1α基因功能验证成功,将有利于裸鼹鼠耐低氧机制研究,并为人类缺氧相关疾病防治提供理论依据。

CRISPR/Cas12f及其衍生基因工程工具的研究进展

CRISPR关联基因12f(Cas12f)由于蛋白序列短,便于基因递送及后续的基因治疗,受到广泛的关注及越来越多的研究报道。本文系统性地回顾和总结了基因编辑系统CRISPR(成簇的规则间隔短回文重复序列)/Cas12f及其衍生的相关基因编辑工具的研究进展,深入探讨了Cas12f的结构特性、间隔子相邻基序(PAM)识别与切割机制,以及基于CRISPR/Cas12f的碱基编辑和转录调控,以期为进一步开发基于Cas12f的基因编辑及治疗工具提供参考。

Construction of Electrochemical Biosensors Based on the CRISPR/Cas12 System for Applications

The current major issue in improving detection sensitivity and selectivity is to design an electrochemical sensor that does not require PCR amplification for nucleic acid identification and measurement. Because of their great sensitivity, precision, and simplicity of downsizing, electrochemical biosensors have emerged as a research hotspot in the field of nucleic acid detection. The CRISPR/Cas12 system has emerged as a potent tool for nucleic acid detection due to its powerful cleavage activity and selectivity. Specific electrode changes combined with the CRISPR/Cas12 system can greatly improve the performance of electrochemical biosensors. In this study, the design concepts of electrochemical biosensors based on the CRISPR/Cas12 system and their application advancements in nucleic acid detection are discussed.