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CRISPR/Cas12f及其衍生基因工程工具的研究进展
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作者 陶天赋 王刚 《生物化工》 CAS 2024年第3期173-178,共6页
CRISPR关联基因12f(Cas12f)由于蛋白序列短,便于基因递送及后续的基因治疗,受到广泛的关注及越来越多的研究报道。本文系统性地回顾和总结了基因编辑系统CRISPR(成簇的规则间隔短回文重复序列)/Cas12f及其衍生的相关基因编辑工具的研究... CRISPR关联基因12f(Cas12f)由于蛋白序列短,便于基因递送及后续的基因治疗,受到广泛的关注及越来越多的研究报道。本文系统性地回顾和总结了基因编辑系统CRISPR(成簇的规则间隔短回文重复序列)/Cas12f及其衍生的相关基因编辑工具的研究进展,深入探讨了Cas12f的结构特性、间隔子相邻基序(PAM)识别与切割机制,以及基于CRISPR/Cas12f的碱基编辑和转录调控,以期为进一步开发基于Cas12f的基因编辑及治疗工具提供参考。 展开更多
关键词 crispr/cas12f 基因编辑 研究进展
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基于CRISPR/Cas12a的叶酸代谢位点MTHFR基因C677T多态性检测方法的建立
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作者 田石 安莉莎 +3 位作者 马瑶 金孝华 马旭 张璐 《生殖医学杂志》 CAS 2024年第6期785-791,共7页
目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略... 目的开发一种基于CRISPR/Cas12a技术的叶酸代谢位点c.677(MTHFR C677T)的高效检测方法,以实现对C677T多态性的快速、准确分析。方法采用重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR/Cas12a建立单管检测反应体系,建立人MTHFR基因C677T基因分型策略;测试200例孕妇人群样本MTHFR基因C677T多态性,并与常规PCR产物测序结果进行一致率比较。结果基于CRISPR/Cas12a检测人MTHFR基因C677T多态性的检测方法结果准确、特异性好,与PCR产物测序结果具有高度一致性。结论建立的基于CRISPR/Cas12a检测技术的人MTHFR C677T基因分型方法简单、快捷、精准,为叶酸代谢位点MTHFR C677T基因型检测提供了新的途径,具有潜在的临床应用前景。 展开更多
关键词 人亚甲基四氢叶酸还原酶基因 多态性 crispr/cas12a 恒温扩增
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CRISPR/Cas12a技术在动物疫病检测方面的应用
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作者 孔玉方 王慧煜 +2 位作者 袁向芬 许晓琳 吴绍强 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2024年第4期92-97,共6页
CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文... CRISPR/Cas系统是由簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关蛋白(Cas)组成的一种基因编辑技术,可以特异地切割和识别靶标核酸基因。该技术具有检测速度快、灵敏度高和特异性强的优势,因此被广泛应用于动物疫病检测领域。本文就CRISPR/Cas12a结合等温核酸扩增技术和可视化技术在动物疫病检测中的应用进行综述,并对其应用前景进行展望,以期为我国的养殖业和进境动物疫病的监测提供技术支撑。 展开更多
关键词 簇状规则间隔的短回文重复序列及其相关蛋白12a(crispr/cas12a) 动物疫病 核酸检测 试纸条
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RT-RAA联合CRISPR/Cas12a快速检测新型冠状病毒方法的建立与评价
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作者 章太婵 车玉传 +5 位作者 梁雪雁 韦华贵 范向平 黄承仕 林敏 陈江涛 《临床检验杂志》 CAS 2024年第4期246-251,共6页
目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计R... 目的建立一种基于反转录酶-重组酶介导等温核酸扩增技术(RT-RAA)联合簇状规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas12a系统的快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的方法,并对其进行评价。方法根据NCBI数据库中SARS-CoV-2的核衣壳(N)基因设计RT-RAA引物和CRISPR来源RNA(crRNA),优化检测体系中乙酸镁(MgAc)用量、RT-RAA反应温度和时间以及LbCas12a反应温度。以100~106 copies/μL重组质粒和其他呼吸道病原体分别评估该方法灵敏度和特异性。采用RT-RAA-CRISPR/Cas12a法和RT-PCR法对70份临床标本进行平行检测,比较两种方法的符合率。结果优化后的RT-RAA-CRISPR/Cas12a检测方法可在37℃条件下50 min内完成SARS-CoV-2检测。荧光法检测灵敏度为10 copies/μL,侧流层析法为1×102 copies/μL。该方法能特异检测SARS-CoV-2,与其他呼吸道病原体无交叉反应。RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测70份临床标本的结果与RT-PCR法完全一致,符合率为100%。结论建立的RT-RAA-CRISPR/Cas12a法检测SARS-CoV-2快速、经济、灵敏度高、特异性强,无需昂贵仪器设备,可由经验不足的人员操作,为临床快速诊断和现场大规模筛查SARS-CoV-2提供了新的思路和方法。 展开更多
关键词 新型冠状病毒 重组酶介导等温扩增 crispr/cas12a 侧流层析 快速检测
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基于CRISPR Cas12a的等温核酸检测技术用于新型隐球菌高敏诊断的临床研究
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作者 叶辛 刘伊诺 +9 位作者 张蕾 罗明明 李俊玉 张黎明 方文捷 刘馨遥 冉玉平 潘炜华 许斌 廖万清 《广西医科大学学报》 CAS 2024年第4期483-488,共6页
目的:构建基于CRISPR Cas12a的高敏等温核酸检测方法,并评估其在支气管肺泡灌洗液及脑脊液中对于新型隐球菌的诊断能力。方法:利用NCBI Blast确定新型隐球菌保守序列,针对保守序列,设计等温重组酶聚合酶扩增引物及crRNA序列。利用新型... 目的:构建基于CRISPR Cas12a的高敏等温核酸检测方法,并评估其在支气管肺泡灌洗液及脑脊液中对于新型隐球菌的诊断能力。方法:利用NCBI Blast确定新型隐球菌保守序列,针对保守序列,设计等温重组酶聚合酶扩增引物及crRNA序列。利用新型隐球菌标准菌株及其他菌株(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌),提取其核酸,以评估方法的特异性及最低检测限。进一步收集临床确诊的10例肺部及10例中枢神经系统新型隐球菌感染患者的支气管肺泡灌洗液及脑脊液,以评估本研究构建的核酸诊断方法的临床检测性能。结果:共设计6组引物及crRNA组合,经筛选得到1组最佳组合。本研究构建的检测方法特异性高(与7种其他类型菌株无交叉反应),最低检测限达到5 copies/μL,整个检测流程速度快(在1 h内完成)。针对10例支气管肺泡灌洗液及10例脑脊液临床标本的阳性检出率均为100%。结论:本研究构建的新型核酸检测方法,具有高度的特异性和良好的检测限,在临床标本检测中同样具有优良检测性能,具备了较强的临床新型隐球菌核酸检测的应用潜力。 展开更多
关键词 新型隐球菌 等温重组酶聚合酶扩增 crispr cas12a 临床诊断
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NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的建立
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作者 樊成 曾昊 +6 位作者 卢星月 康婕 雷兰兰 刘静 郑玉红 钱卫东 王婷 《中国动物检疫》 CAS 2024年第8期90-97,共8页
近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计... 近年来,一种新的诺如病毒GⅡ.2亚型(norovirus GⅡ.2,NoV GⅡ.2)通过牡蛎等生食海鲜感染人群,引发急性胃肠炎,并在全球广泛传播。为实现NoV感染的现场诊断和快速疫情响应,亟需建立快速便捷的NoV GⅡ.2亚型核酸检测方法。本研究通过设计引物、crRNA,经优化反应条件后,建立了NoV GⅡ.2亚型RTRPA-CRISPR/Cas12a检测方法。结果显示:利用引物NoV-GⅡ.2-F1B和NoV-GⅡ.2-R1对NoV GⅡ.2标准RNA进行RT-RPA扩增,结合crRNA1介导的CRISPR/Cas12a报告体系,能在40 min内完成NoV GⅡ.2核酸检测;该方法检测灵敏度为10 copies/μL,且与轮状病毒、腺病毒、星形病毒、人副肠孤病毒、博卡病毒和札如病毒无交叉反应;应用该方法和qRT-PCR法,分别对30份临床模拟样本进行检测,发现总符合率达96.67%。结果表明,本研究建立的NoV GⅡ.2亚型RT-RPA-CRISPR/Cas12a检测方法无需依赖昂贵设备,具有灵敏度高、特异性强、操作便捷快速等特点,为NoV GⅡ.2感染的现场检测和防控提供了新方法。 展开更多
关键词 NoV GⅡ.2亚型 反转录重组酶聚合酶扩增 crispr/cas12a系统 快速检测
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基于RPA-CRISPR/Cas12a的番茄花叶病毒可视化检测方法的建立
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作者 董铮 赵振兴 +3 位作者 范奇璇 王思元 周涛 张永江 《植物保护》 CAS CSCD 北大核心 2024年第4期235-241,共7页
番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶... 番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,ToMV)属于植物杆状病毒科Virgaviridae烟草花叶病毒属Tobamovirus成员,主要危害番茄和辣椒,多数茄科植物易感染,严重影响果实的品质和产量。本研究根据ToMV编码的外壳蛋白的基因保守序列,设计重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物和簇状规则间隔短链重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)及相关蛋白12a(CRISPR-associated 12a,Cas12a)的crRNA并挑选报告基因。通过优化反应体系建立了ToMV的快速可视化检测方法,当荧光报告基因FQ终浓度为400 nmol/L、Cas12a/crRNA比例为1∶5、终浓度为200 nmol·L^(-1)/1000 nmol·L^(-1)时检测信号最强,只需RPA和CRISPR/Cas12a分别反应15 min,即可在便携式蓝光照射设备下直接观察到阳性信号。该方法可特异性检测ToMV,对携带ToMV样品的RNA检测灵敏度可以达到172 ag/μL,是普通RT-PCR检测灵敏度的10000倍,可用于ToMV快速灵敏的可视化检测。 展开更多
关键词 番茄花叶病毒 RPA crispr/cas12a 可视化检测
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鼠伤寒沙门氏菌CRISPR/Cas12a检测方法的建立与应用
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作者 李丹 袁梦君 +3 位作者 王旭 李文豪 张鸿雁 王恬 《食品安全质量检测学报》 CAS 2024年第12期143-150,共8页
目的建立快速、超灵敏检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法根据鼠伤寒沙门氏菌fliC基因保守片段设计并合成特异性CRISPR RNA(crRNA),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)... 目的建立快速、超灵敏检测食品中鼠伤寒沙门氏菌的方法。方法根据鼠伤寒沙门氏菌fliC基因保守片段设计并合成特异性CRISPR RNA(crRNA),并根据crRNA所在的基因序列区域设计重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)特异性引物,利用RPA技术扩增样本核酸,并对扩增产物进行CRISPR/Cas12a荧光检测。结果该检测方法克服了传统鼠伤寒沙门氏菌检测方法的缺陷,耗时短且具有较高的灵敏度,对鼠伤寒沙门氏菌的检出限低至1copy/μL,与乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、大肠埃希氏菌等常见食源性致病菌核酸检测无交叉反应,且建立的方法在检测人工污染的食品样品时具有较高的灵敏度和准确性。结论本研究建立的检测方法耗时短、灵敏度高,可用于鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。 展开更多
关键词 crispr/cas12a 重组酶聚合酶扩增 鼠伤寒沙门氏菌 快速检测
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基于AIEgens增强的CRISPR/Cas12a荧光探针设计及在单核细胞增生李斯特菌快速检测中的应用
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作者 叶莎玲 董香梅 +1 位作者 郭宇乾 熊勇华 《南昌大学学报(理科版)》 CAS 2024年第3期251-260,共10页
研制了一种基于聚集诱导发光染料(aggregation-induced emission fluorogens,AIEgens)增强的荧光探针,建立了基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合CRISPR/Cas12a高灵敏检测单核细胞增生李斯特菌(Listeri... 研制了一种基于聚集诱导发光染料(aggregation-induced emission fluorogens,AIEgens)增强的荧光探针,建立了基于重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)结合CRISPR/Cas12a高灵敏检测单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)的新方法。利用阳离子AIEgens与双链DNA结合荧光极大增强的特性,构建了一种含双链以及单链DNA的探针。该探针5’末端携带一个荧光淬灭基团,双链DNA片段结合了多个AIEgens;利用crRNA可准确识别靶标序列并激活Cas12a反式切割活性的特点,切割荧光探针单链DNA产生荧光信号,从而实现LM高灵敏检测。将AIEgens增强型荧光探针与CRISPR/Cas12a结合,在无扩增情况下检测DNA片段的检出限为0.37 pmol·L^(-1),灵敏度较传统荧光探针高40倍。将以上检测体系与RPA反应联用,检测LM的检出限为3×10^(1) CFU·mL^(-1);该方法检测人工污染LM的牛奶以及金针菇样本,批内以及批间平均回收率介于91.14%~108.47%,变异系数小于12.71%。构建了一种基于AIEgens增强的CRISPR/Cas荧光探针,极大地提高了基于荧光信号输出的CRISPR/Cas方法检测灵敏度,实现了食源性致病菌的高灵敏检测。 展开更多
关键词 crispr/cas12a 聚集诱导发光分子 单核细胞增生李斯特菌 食源性致病菌 快速检测
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基于CRISPR/Cas12a的生物传感平台的机制研究及应用
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作者 陈墨岩 祝诚 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期90-98,共9页
CRISPR/Cas12a系统能够由可编程的RNA引导,准确识别特异的单链DNA或含有PAM序列的双链DNA,而后在目标底物进行切割的同时完成对非特异性单链DNA的迅速切割,该特性使其在生物传感应用中显示出巨大前景。近年来,CRISPR/Cas12a系统被广泛... CRISPR/Cas12a系统能够由可编程的RNA引导,准确识别特异的单链DNA或含有PAM序列的双链DNA,而后在目标底物进行切割的同时完成对非特异性单链DNA的迅速切割,该特性使其在生物传感应用中显示出巨大前景。近年来,CRISPR/Cas12a系统被广泛应用于生物标志物的辅助检测,其生物标志物传感平台已在可视化细胞途径、体内活体诊断等生物分子传感器的构建方面得到应用。本文基于CRISPR/Cas12a生物传感平台的构建原理,对不同应用情景下CRISPR/Cas12a系统的变体进行了总结,并对基于该系统的体外、体内传感平台的应用进行了重点介绍和归纳,进一步讨论了不同传感平台的特点。最后对目前应用的优点和局限性做出总结和展望,以期为该领域的研究与应用提供一定参考。 展开更多
关键词 crispr/cas12a 体外生物传感 体内生物传感 准确识别
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微型CRISPR核酸酶Cas12f研究进展及在基因编辑领域中的应用
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作者 刘亭君 陈祥凤 +2 位作者 王俊利 林敏 董明右 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第2期172-179,共8页
成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统是一种存在于大多数细菌和古菌中的“获得性免疫系统”,已被广泛应用于生物、医学等多个研究领域。传统的Cas核酸酶(Cas9、Cas12和Cas13)因为分子尺寸较大,将基因编辑工具... 成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR-Cas)系统是一种存在于大多数细菌和古菌中的“获得性免疫系统”,已被广泛应用于生物、医学等多个研究领域。传统的Cas核酸酶(Cas9、Cas12和Cas13)因为分子尺寸较大,将基因编辑工具精确送到真核细胞内受到阻碍。研究发现,Cas12f是目前已知的最小RNA引导核酸酶,有着与众不同的属性:除分子比较小外;对单链DNA切割不需要靶标前间区序列邻近基序(Protospacer adjacent motif,PAM);非常长的(153~169个核苷酸)反式激活crRNA(tracrRNA);结合单拷贝向导RNA(gRNA)后的二聚化;不对称的双链切割模式;针对单链DNA的附带切割活性;对识别序列中间的碱基要求严格等。基于目前研究,Cas12f具体作用机制尚不明确,本文对近年来CRISPR-Cas12f起源、分类、作用机制及其在基因编辑领域中应用的研究进行综述,以期开发微型Cas12f精准基因编辑和治疗工具,同时为相关研究领域的科研工作提供参考。 展开更多
关键词 crispr cas12f 单链DNA 基因编辑
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基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD的犀牛特异性检测技术
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作者 王瑛 张冲 +4 位作者 蔡一村 王鑫杰 林颖峥 冯之航 潘良文 《野生动物学报》 北大核心 2023年第4期798-806,共9页
野生犀牛(Rhinocerotidae)种群的生存正面临极大威胁,包括栖息地减少、碎片化及偷猎等,在对打击犀牛角等非法贸易的努力中,物种的特异性检测至关重要,为了在现场就可以迅速完成犀牛源性成分鉴定,将酶促重组等温扩增(enzymatic recombina... 野生犀牛(Rhinocerotidae)种群的生存正面临极大威胁,包括栖息地减少、碎片化及偷猎等,在对打击犀牛角等非法贸易的努力中,物种的特异性检测至关重要,为了在现场就可以迅速完成犀牛源性成分鉴定,将酶促重组等温扩增(enzymatic recombinase amplification,ERA)、CRISPR/Cas12a和侧向流试纸条(lateral flow dipstick,LFD)技术相结合,研发了一种适于现场使用的犀牛特异性核酸检测方法。结果表明:该方法只能检测出5种现生犀牛特异性核酸,与其他哺乳动物核酸测试样本没有交叉反应,最低检测下限可达100拷贝/孔,具有较好的特异性和灵敏度。该方法可以在36.5~40.0℃条件下,27~30 min完成特异性识别,无需高规格的实验室环境和精密仪器,从而提供更快、更准确和更灵敏的检测方案。 展开更多
关键词 犀牛源性成分 crispr/cas12a 酶促重组等温扩增 侧向流试纸条
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Targeting miRNA by CRISPR/Cas in cancer:advantages and challenges
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作者 Bashdar Mahmud Hussen Mohammed Fatih Rasul +10 位作者 Snur Rasool Abdullah Hazha Jamal Hidayat Goran Sedeeq Hama Faraj Fattma Abodi Ali Abbas Salihi Aria Baniahmad Soudeh Ghafouri-Fard Milladur Rahman Mark C.Glassy Wojciech Branicki Mohammad Taheri 《Military Medical Research》 SCIE CAS CSCD 2024年第3期345-373,共29页
Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats(CRISPR)has changed biomedical research and provided entirely new models to analyze every aspect of biomedical sciences during the last decade.In the study of ... Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats(CRISPR)has changed biomedical research and provided entirely new models to analyze every aspect of biomedical sciences during the last decade.In the study of cancer,the CRISPR/CRISPR-associated protein(Cas)system opens new avenues into issues that were once unknown in our knowledge of the non-coding genome,tumor heterogeneity,and precision medicines.CRISPR/Cas-based geneediting technology now allows for the precise and permanent targeting of mutations and provides an opportunity to target small non-coding RNAs such as microRNAs(miRNAs).However,the development of effective and safe cancer gene editing therapy is highly dependent on proper design to be innocuous to normal cells and prevent introducing other abnormalities.This study aims to highlight the cutting-edge approaches in cancer-gene editing therapy based on the CRISPR/Cas technology to target miRNAs in cancer therapy.Furthermore,we highlight the potential challenges in CRISPR/Cas-mediated miRNA gene editing and offer advanced strategies to overcome them. 展开更多
关键词 crispr crispr/cas9 crispr/cas12 Gene editing MIRNAS cancer therapy
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基于CRISPR/Cas12a系统的新型创伤弧菌试纸条检测方法的建立 被引量:2
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作者 罗元丰 林子琴 +5 位作者 王玲梦 董晶晶 袁褀恒 楼永良 赵玲玲 肖星星 《动物医学进展》 北大核心 2023年第7期55-61,共7页
创伤弧菌(VV)是一种重要的人畜共患和水生动物病原体,能引起人类和水生动物的弧菌病,严重影响人身健康和水产养殖业发展。快速、灵敏、准确的VV检测方法对于保障人民生命健康、降低水产养殖业损失至关重要。为建立一种新型VV检测方法,... 创伤弧菌(VV)是一种重要的人畜共患和水生动物病原体,能引起人类和水生动物的弧菌病,严重影响人身健康和水产养殖业发展。快速、灵敏、准确的VV检测方法对于保障人民生命健康、降低水产养殖业损失至关重要。为建立一种新型VV检测方法,基于重组酶辅助扩增(RAA)技术和基于成簇的规律间隔的短回文重复序列和CRISPR相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a)系统,构建了一种通过试纸条(LFS)读取VV检测结果的方法RAA-CRISPR/Cas12a-LFS。该方法不依赖精密仪器,通过肉眼读取LFS结果便可快速、灵敏、准确检测VV,检测限为10 copies/μL VV基因组DNA,检测时间约为60 min。此外,该方法具有高特异性,并可准确检出血液、粪便、虾类等加标样品中的VV。因此,所构建的VV检测方法RAA-CRISPR/Cas12a-LFS兼具简便、快速、灵敏、准确的特性,有望用于弧菌病早期诊断以及水产品VV感染/污染情况的现场检测。 展开更多
关键词 创伤弧菌 crispr/cas12a 重组酶辅助扩增 试纸条 检测
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基于RAA-CRISPR/Cas12a快速检测尼帕病毒方法的建立
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作者 徐蛟 王英丽 +5 位作者 王莹 常星 张永强 李金明 包静月 王志亮 《中国动物检疫》 CAS 2023年第10期95-99,111,共6页
本研究建立了一种基于重组酶介导的扩增技术(RAA)以及CRISPR/Cas12a系统快速检测尼帕病毒(NiV)的方法。针对NiV N和F基因分别设计RAA引物和crRNA,构建反应体系,通过前期对引物、crRNA、反应温度以及反应时间等条件筛选优化建立起高效灵... 本研究建立了一种基于重组酶介导的扩增技术(RAA)以及CRISPR/Cas12a系统快速检测尼帕病毒(NiV)的方法。针对NiV N和F基因分别设计RAA引物和crRNA,构建反应体系,通过前期对引物、crRNA、反应温度以及反应时间等条件筛选优化建立起高效灵敏的检测方法,并评估了该方法的敏感性、特异性和重复性。结果显示:建立的方法在37℃恒温条件下,1h即可完成检测,最低检测限能够达到102拷贝/μL,敏感性较高;特异性强,与口蹄疫病毒(FMDV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)等常见猪病毒均无交叉反应;稳定性较好,对低、中、高浓度病毒质粒均能成功检出且一致性较好。结果表明,本试验建立的NiV快速检测方法操作简单、特异性强、灵敏度高、稳定性好,不需要复杂设备,在蓝光下通过肉眼即可观察结果,可为实现NiV早期快速检测提供有力的技术支持。 展开更多
关键词 重组酶介导扩增技术 crispr/cas12a 尼帕病毒 检测方法
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利用CRISPR/Cas12a与SERS技术对HPV核酸的快速检测
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作者 苏艾玲 曹修冕 +1 位作者 徐蔚青 徐抒平 《光谱学与光谱分析》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2023年第S01期191-192,共2页
为了有效预防宫颈癌的发生以及更好的术后跟踪治疗,实现对HPV病毒DNA快速可靠的检测是至关重要的。与传统方法相比,通过缩短检测时间和减少劳动力来进一步简化HPV病毒DNA检测仍然是一个挑战。该研究提出了一种基于CRISPR/Cas12a对基因的... 为了有效预防宫颈癌的发生以及更好的术后跟踪治疗,实现对HPV病毒DNA快速可靠的检测是至关重要的。与传统方法相比,通过缩短检测时间和减少劳动力来进一步简化HPV病毒DNA检测仍然是一个挑战。该研究提出了一种基于CRISPR/Cas12a对基因的SERS检测方法。主要利用目标病毒核酸与Cas12a、crRNA形成三元复合体,开启切割体系中的底物单链DNA(ssDNA)。ssDNA可以连接探针1(AuNPs@MBN@DNA1)和探针2(AuNPs@MBN@DNA2)。探针1和探针2是否被桥连可引起SERS信号的变化,即可知待检样品中是否含有目标核酸。利用特异性的crRNA可以实现对病毒核酸的准确快速检测。该传感方法可在40 min内实现对HPV基因的高灵敏度检测。由于DNA探针和crRNA设计的灵活性,该CRISPR/Cas-SERS传感系统可以扩展成一种通用的基因检测工具,有望在体外诊断领域和检测中具有广阔的应用前景。 展开更多
关键词 crispr/cas12a SERS 病毒基因检测
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结合CRISPR/Cas12b与LAMP技术的乳粉中克罗诺杆菌属的检测
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作者 张懿翔 张清平 刘洋 《中国乳品工业》 CAS 北大核心 2023年第12期54-58,共5页
将CRISPR/Cas12b与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法相结合,应用于乳粉中克罗诺杆菌属的检测。通过基因组比较寻找克罗诺杆菌菌株基因内部的候选保守序列,针对克罗诺杆菌属特异性关键基因序列设计L... 将CRISPR/Cas12b与环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法相结合,应用于乳粉中克罗诺杆菌属的检测。通过基因组比较寻找克罗诺杆菌菌株基因内部的候选保守序列,针对克罗诺杆菌属特异性关键基因序列设计LAMP引物和向导RNA靶向序列,对其进行条件优化、特异性检测,并用人工污染样品对体系的灵敏度、重复性进行验证。结果表明该方法具有良好的特异性,方法的灵敏度达到了0.1 pg/μL;人工污染样品可检测到初始菌量<10 CFU/g的样品,方法检出限为<10 CFU/100 g。将该方法应用于51份市售乳粉样品以及52份模拟生产环境样品的检测,结果与传统国标方法一致,并且大幅缩短了实验时间。该方法可用于乳粉中克罗诺杆菌属的快速检测。 展开更多
关键词 crispr cas12b 克罗诺杆菌属 环介导等温扩增
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基于RPA-CRISPR/Cas12a技术快速检测犬猫皮肤癣菌方法的建立
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作者 郜平平 付金玉 +3 位作者 王丽仰 史硕博 张跃平 张迪 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第11期4702-4711,共10页
旨在建立重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)结合CRISPR/Cas12a技术的荧光检测方法,以快速、灵敏、可视化检测犬猫皮肤癣菌。以犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌为研究对象,针对真菌内转录间隔区,设... 旨在建立重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)结合CRISPR/Cas12a技术的荧光检测方法,以快速、灵敏、可视化检测犬猫皮肤癣菌。以犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌为研究对象,针对真菌内转录间隔区,设计并合成特异性RPA引物和CRISPR RNA(crRNA),建立可同时或分别检测上述皮肤癣菌的荧光检测方法,并评价其检测灵敏度,通过检测临床样本评价本检测方法的敏感性和特异性。结果表明:RPA-CRISPR/Cas12a在37℃、总反应时间30 min的条件下,对三种皮肤癣菌的检测灵敏度可低至单拷贝。对24份临床样本进行检测,以真菌培养和菌落测序结果作为标准,使用可同时识别犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌的皮肤癣菌crRNA(dermatophyte crRNA,crRNA-DM)和可特异性识别犬小孢子菌的犬小孢子菌crRNA(Microsporum canis crRNA,crRNA-Mc)参与RPA-CRISPR/Cas12a反应时,敏感性和特异性均为100%。RPA-CRISPR/Cas12a技术可同时和分别检测犬小孢子菌、石膏样小孢子菌及须毛癣菌,所需时间短,结果可视化,敏感性和特异性高,无需昂贵仪器,适合临床快速诊断。 展开更多
关键词 RPA crispr/cas12a 犬猫皮肤癣菌 快速检测
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微小隐孢子虫RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法的建立及应用
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作者 王丽 李珊 +5 位作者 李璐 张西臣 王晓岑 李新 张楠 宫鹏涛 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2023年第12期4793-4804,共12页
【目的】建立一种快速、准确、灵敏的微小隐孢子虫可视化检测方法。【方法】本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术与CRISPR/Cas12a系统相结合,通过荧光检测法和侧流层析试纸条读取结果。针对微小隐... 【目的】建立一种快速、准确、灵敏的微小隐孢子虫可视化检测方法。【方法】本研究将重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术与CRISPR/Cas12a系统相结合,通过荧光检测法和侧流层析试纸条读取结果。针对微小隐孢子虫的小亚基核糖体RNA(small subunit ribosome RNA,SSU rRNA)基因设计和筛选crRNA和RPA引物,利用两种不同的单链DNA报告分子以荧光数值和侧流层析试纸条呈现检测结果。通过检测微小隐孢子虫和7个其他病原体评估RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的特异性。通过梯度稀释的重组质粒和微小隐孢子虫基因组评估RPA-CRISPR/Cas12a检测方法的敏感性,并将该方法应用于临床样本的检测。【结果】本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法可在90 min内完成对样本中微小隐孢子虫的检测,与大肠杆菌、十二指肠贾第虫、华支睾吸虫、弓形虫、肝片吸虫、人五毛滴虫、沙门菌均无交叉反应,可特异性检测出微小隐孢子虫;敏感性试验结果显示,该方法的最低检测限为10个卵囊/mL。利用此方法对70份牛粪便样本和50份人粪便样本进行检测,经荧光检测法和侧流层析试纸条读取结果,微小隐孢子虫的阳性率分别为15.7%(11/70)和6.0%(3/50),与套式PCR检测结果完全一致。【结论】本研究建立的微小隐孢子虫RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测方法具有高特异性和高灵敏度,且检测结果直观,不依赖昂贵的仪器设备,在微小隐孢子虫的现场检测和风险监测方面具有广阔的应用价值。 展开更多
关键词 crispr/cas12a 微小隐孢子虫 重组酶聚合酶扩增 可视化检测
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CRISPR/Cas12b核酸检测试剂的冻干配方筛选与优化
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作者 张胜胜 吴芳 +3 位作者 罗志丹 王天琪 黄庆媛 卢辰 《江苏海洋大学学报(自然科学版)》 CAS 2023年第3期43-48,共6页
为解决现有CRISPR/Cas12b核酸检测试剂需要冷链储运的问题,选取海藻糖、乳糖、蔗糖、普鲁兰多糖、酪蛋白、麦芽糊精、松三糖和甘露醇等8种常用的冻干保护剂,以真空冷冻干燥后相对酶活和物理状态为指标,通过对不同浓度保护剂的单因素试... 为解决现有CRISPR/Cas12b核酸检测试剂需要冷链储运的问题,选取海藻糖、乳糖、蔗糖、普鲁兰多糖、酪蛋白、麦芽糊精、松三糖和甘露醇等8种常用的冻干保护剂,以真空冷冻干燥后相对酶活和物理状态为指标,通过对不同浓度保护剂的单因素试验和正交试验,筛选与优化冻干配方。结果表明,海藻糖、普鲁兰多糖和甘露醇具有较好的冻干保护性,且冻干产物物理性状较好,便于使用。最终确定的冻干配方为海藻糖0.14 g/mL,普鲁兰多糖0.06 g/mL,甘露醇0.06 g/mL。使用该配方制备的CRISPR/Cas12b冻干试剂,初始相对酶活为93.33%,在25℃保存60 d或37℃保存30 d后的相对酶活分别为81.04%和81.28%,具有良好的常温保存性,可用于进一步制备快速核酸检测试剂。 展开更多
关键词 crispr/cas12b 核酸检测 真空冷冻干燥
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