CRISPR/Cas9基因编辑系统在作物抗性品种选育中的应用

CRISPR/Cas9基因编辑技术因周期短、效率及精确度高、载体构建简单等优点,成为目前作物抗性品种选育的最佳分子育种工具。概述了CRISPR/Cas9基因编辑系统的基本原理,分析总结了该系统在作物抗旱性、抗盐性、抗冷性、抗重金属盐及抗除草剂品种选育中的应用,以期为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术选育更多优质作物抗性品种提供参考。

针对非洲猪瘟病毒p30基因CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建和初步鉴定

构建针对非洲猪瘟病毒(ASFV)p30(CP204L)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,探究该系统对p30蛋白真核表达的影响。以含p30基因序列的质粒p30-IRES为模板,定向扩增目的基因片段并克隆至pmCherry-N1载体,构建含有p30、红色荧光报告基因的融合表达质粒;通过网站http://crispr.mit.edu/设计靶向CP204L的单导向RNA(sgRNA),并克隆至Cas9表达质粒eSpCas9-2A-GFP(PX458)中。将融合表达质粒与Cas9表达质粒共转染HEK 293T细胞,同时设置对照组,转染48 h后通过Western blot和荧光定量PCR(qPCR)方法分别检测转染细胞中p30蛋白和mRNA表达水平。由于CRISPR/Cas9基因编辑系统靶向切割p30基因,Western blot和qPCR结果显示转染靶向p30基因的Cas9质粒后,p30蛋白的真核表达受到抑制,具有显著性差异(P<0.05)。结果表明,CRISPR/Cas9基因编辑系统可以高效切割非洲猪瘟p30基因,抑制该蛋白的真核表达水平,该体系为抑制病毒生长和疫情防控提供了新的研究思路。

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在微藻中的应用

微藻是单细胞光合原生生物的统称。微藻富含高价值的产物,如蛋白质、DHA、虾青素等,广泛用于食品、保健品、化妆品和饲料生产。基因编辑技术是微藻遗传学研究和遗传改良的新工具。目前,广泛使用的基因编辑技术有锌指蛋白-核酸酶系统(zinc-finger nucleases system,ZFN)、转录激活样效应蛋白-核酸酶系统(transcription activator-like effector nucleases system,TALEN)和成簇规则间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR合作蛋白系统[clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)system],简称CRISPR/Cas系统。ZFN和TALEN融合了DNA特定序列识别蛋白和核酸内切酶,需要根据拟识别DNA序列修改识别蛋白氨基酸序列,过程繁琐,效率低,而CRISPR/Cas系统操作简便,只需设计拟识别DNA序列小引导RNA即可,编辑效率高,可同步编辑多个基因。目前,已有编辑干扰、编辑激活、编辑敲除、编辑插入等衍生系统,还有引导编辑、碱基编辑等,也可以编辑RNA分子。CRISPR/Cas在微藻中应用广泛。本文综述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在微藻中的应用现状。

CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展及其在动物基因编辑研究中的应用

CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)系统是由一种短小RNA调控的对DNA修饰的基因编辑工具,是一种较锌指核酸酶(Zinc-fingers nuclease,ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(Transcription activator-like(TAL)effector nucleases,TALEN)打靶更加快速、高效、精准的新型基因组编辑工具,它易于设计,且具有特异性。本文回顾了CRISPR/Cas系统的结构与功能,概述了Cas9的设计策略、影响Cas9基因编辑效率的因素、脱靶检测分析方法及其在动物基因编辑研究中的应用。基于CRISPR/Cas9已经在多种动物上成功实现了基因编辑,它有望成为建立动物模型和研究疾病防治的一种新型可行性途径。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在肿瘤研究中的应用进展

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated nuclease 9)基因编辑系统是基于古细菌抵御外源核酸入侵的免疫机制为基础开发出来的一种新型的基因编辑技术。相对于传统的基因编辑系统,该系统具有更加高效、操作简单、细胞毒性小等特点。目前,CRISPR/Cas9基因编辑技术已经在肿瘤研究的诸多方面中得到应用,包括肿瘤相关基因的功能研究、构建动物肿瘤模型、筛选肿瘤细胞表型及耐药相关基因以及肿瘤的基因治疗等诸多方面。本文就其在肿瘤研究中的应用进展进行综述。

CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述

综述了CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用。在水稻基因组水平上进行基因定向编辑改造对水稻育种具有重要意义。CRISPR/Cas9基因编辑系统是近几年来研究发现的一种定点基因组编辑新工具,仅需要短RNA和核酸酶就可以对特定的靶标基因进行突变,因其简便高效而被广泛应用于包括水稻在内的多种生物的基因组编辑中。

建立靶向CXCR7基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用

目的构建靶向CXCR7基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,并应用于HEK 293T细胞系。方法设计两对靶向CXCR7基因的sgRNAs,分别插入PX458载体中,并转化DH5α大肠埃希菌。经菌液PCR和测序验证,挑选序列正确的sgRNA-CXCR7-PX458质粒,转染HEK 293T细胞,用流式分选转染阳性细胞,提取其DNA,PCR扩增后测序验证。结果经测序验证,成功构建了靶向CXCR7基因的CRISPR/Cas9系统,转染HEK 293T细胞后,测序鉴定发现成功编辑CXCR7基因。结论成功构建了靶向CXCR7的sgRNA-CXCR7-PX458质粒,可在HEK 293T上成功编辑CXCR7基因,为进一步的功能研究奠定基础。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在食药用真菌中的研究进展

CRISPR/Cas9是目前最成功的基因组精准编辑技术。迄今为止至少在9种食药用真菌中已有相关的应用报道,包括刺芹侧耳(杏鲍菇)、糙皮侧耳(平菇)、双孢蘑菇、灵芝、裂褶菌、灰盖鬼伞、金针菇、蛹虫草和竹黄菌。本文综述了CRISPR/Cas9系统的工作原理及递送策略,针对在食药用真菌中应用存在的一些问题进行分析,并提出优化方案。最后借鉴目前CRISPR技术发展的前沿方向,如多基因编辑、碱基编辑、引导编辑、转录调控等,对未来在食药用真菌领域的应用前景进行了展望。

优化大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用

CRISPR/Cas9基因编辑系统目前已经广泛地应用于大肠杆菌工程菌株的构建,若能构建出一种能连续进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统,将极大地提高大肠杆菌工程菌株构建的效率。设计并构建了具有自剪切功能的供体质粒pV4,优化了双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现了基因的连续敲除或整合。pV4质粒,在原始供体质粒placZ的骨架区域添加3个元件:针对供体质粒上氯霉素基因cat的N20-gRNA序列;Ptrc启动子,用于表达cat-N20-gRNA;lacI^q序列,用于表达LacI蛋白调控Ptrc启动子。pV4供体系列质粒(敲除或整合)实现基因编辑后,cat-N20-gRNA在IPTG的诱导表达引导Cas9蛋白对供体质粒进行自剪切,从而方便下一轮基因的编辑。将pV4系列质粒(敲除或整合)应用于产衣康酸工程菌株的构建,连续敲除ptsI、iclR及整合cad基因,基因编辑结果显示,优化后的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,能快速消除供体质粒,实现基因的连续敲除或整合,节约了基因操作的时间,有广泛的工程菌株构建应用前景。

CRISPR/Cas9基因编辑系统的发展及其在医学研究领域的应用

近年来,CRISPR/Cas9技术凭借着其操作方便、设计简单、效率高、成本低以及可同时进行多位点编辑等优势,已成为当今最热的新一代基因编辑技术。CRISPR/Cas9独特的在RNA引导下对DNA进行靶向编辑的作用机制,不仅拓展了各相关领域的科研工作者们对生物体遗传调控的了解,更显示出优良的便捷性。近十年来,该系统在各生物、医学研究领域应用极为广泛,发展迅速。在医学领域,更是显示出极大的潜力。本文从CRISPR/Cas9基因编辑系统的研究历史、作用机理以及该技术在医学领域的应用等方面综述其最新研究进展,为更好地应用和优化CRISPR/Cas9提供参考。

利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统构建HeLa细胞SND1基因敲除稳定株

目的:利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除He La细胞中SND1基因,构建He La细胞SND1基因敲除稳定株。方法:设计一对特异性识别SND1基因第二个启动子的上下游sg RNA,以PX462质粒为载体,构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后,将一对重组质粒共同转染进入He La细胞中,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果:sg RNA正确插入到PX462质粒载体中,转染并筛选单克隆后的细胞中没有SND1蛋白的表达。结论:成功构建出He La细胞SND1基因敲除稳定株。

CRISPR/Cas9基因编辑系统在结直肠癌中的应用进展

结直肠癌(CRC)是常见的恶性肿瘤,在我国发病率有上升趋势。近年来,从基因水平研究结肠癌的发生、发展及预后,寻找更有效的治疗方法已成为热点。成簇规律间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白酶9(CRISPR/Cas9)已成为编辑生物体基因的一项有力工具。它首次在细菌和古生菌内作为适应性免疫系统的一部分被发现,CRISPR/Cas9已广泛用于编辑基因组以及激活或抑制基因的表达。因此,CRISPR/Cas9通过提供有效的技术来分析肿瘤发生机制,鉴定靶向基因药物,有望加快癌症研究。

CRISPR/Cas9基因编辑系统研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑系统被广泛应用于生物学及医学各领域。该系统可在RNA的引导下对特定DNA位点进行靶向编辑。脱靶效应和编辑效率是该系统面临的两大问题。目前已有诸多研究从减少脱靶效应和提高编辑效率的方面对该系统进行优化,将有助于其安全性的提升及应用范围的拓展。

靶向BCOR基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立与基因编辑

目的构建靶向B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6 co-repressor,BCOR)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,并在HEK293T细胞系中进行BCOR基因编辑,为研究BCOR的功能打下基础。方法根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计两对靶向BCOR基因的单链引导RNA(smallguideRNA,sgRNA),将PX458载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到PX458载体中,转化到宿主菌DH5α大肠埃希菌中。过夜后每个sgRNA-PX458质粒挑取3个阳性克隆,进行PCR和测序验证。挑选序列正确的BCOR sgRNA-PX458质粒,转染HEK 293T细胞,进行BCOR基因编辑,采用荧光显微镜及流式细胞学观察HEK 293T细胞绿色荧光蛋白表达的情况,确定是否成功及转染效率,提取HEK 293T细胞DNA,PCR扩增BCOR基因的相应片段,进一步Sanger测序验证,鉴定BCOR sgRNA-PX458 CRISPR/Cas9系统对BCOR基因的编辑能力和效率。结果经测序验证,成功构建了靶向BCOR sgRNAPX458质粒的CRISPR/Cas9系统,转染HEK293T细胞后,可见HEK293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,测序鉴定发现BCOR sgRNA-PX458质粒能够产生插入或者缺失,可以成功编辑BCOR基因。结论成功构建了靶向BCOR的sgRNA-PX458质粒,可在HEK 293T上成功编辑BCOR基因,为进一步研究BCOR的功能奠定了基础。

基于原生质体的谷子CRISPR/Cas9基因编辑系统优化

为了优化和筛选谷子中高效的CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9)基因编辑系统,针对谷子八氢番茄红素脱氢酶基因(SiPDS)设计6种gRNA(gRNA1—gRNA2针对外显子1,gRNA3—gRNA6针对外显子12),构建多种CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过聚乙二醇(PEG)介导的方法转入谷子原生质体中,然后利用开发的大规模平行测序技术快速检测它们对SiPDS的突变效率。结果表明,采用7 d谷子黄化苗幼茎建立的原生质体转化系统的转化效率较高,为50.44%~57.36%。将Super启动子(SP)、谷子内源的泛素启动子(Ubi)分别驱动Cas9基因的基因编辑系统转入谷子原生质体中,发现两者对SiPDS基因的突变效率分别为0.5%、5.5%。随后采用Ubi启动子驱动Cas9基因,比较单一gRNA、双gRNA和tRNA结构的基因编辑系统对SiPDS基因的突变效率,发现双gRNA基因编辑系统Ubi-dgRNAE1和Ubi-dgRNAE12的突变效率分别较单一gRNA基因编辑系统提高了1.66倍和1.11倍;tRNA基因编辑系统Ubi-tRNA的突变效率较单一gRNA基因编辑系统提高了5.87倍,为51.24%,且Ubi-tRNA可同时针对多个位点进行编辑,其多位点突变频率为3.23%。比较gRNA3、gRNA4、gRNA5体外转录产物分别与Cas9蛋白混合制成的核糖核蛋白(RNP)复合物的体外切割活性,发现RNP-gRNA5复合物体外切割活性最高,其对SiPDS基因的突变效率是2.0%,并且引起的突变类型主要为小于3 bp的缺失。

应用CRISPR/Cas9基因编辑系统对HEK293细胞系TSC1基因稳定敲除效果的实验鉴定

目的利用成簇规律间隔短回文重复序列/成簇规律间隔短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas9)基因编辑系统在HEK293细胞系中对TSC1基因稳定敲除,并对其敲除效果进行鉴定。方法根据TSC1基因的序列设计sgRNA,将sgRNA克隆到载体lentilCRISPRv2上,将连接产物转化至Stbl3感受态细胞,对菌液进行测序鉴定。将鉴定成功的lentiCRISPRV2-sgTSC1质粒转染至HEK293细胞,加入嘌呤霉素进行筛选,挑选单细胞克隆进行PCR鉴定,选取条带单一的细胞株用Western blot鉴定TSC1基因的表达。结果成功构建lentiCRISPRV2-sgTSC1-1/2重组质粒,并利用该质粒完成对TCS1基因的定点切割,Western blot结果显示细胞中无TSC1表达。结论用CRISPR/Cas9系统成功构建TSC1基因敲除的稳定细胞株,为后续实验奠定了基础。

编辑ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因的串联DsRed荧光表达盒的CRISPR/Cas9系统的构建及验证

CCT家族基因影响植物开花,在玉米中,ZmCCT10、ZmCCT9基因是光周期敏感基因,ZmGhd7基因是与开花期相关的基因。利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因为研究基因的功能和快速改良玉米的开花期提供了可能。本研究以玉米ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因为编辑对象,以KN5585为稳定转化受体、以CML312SR、LCL-1、LCL-2为预改良的晚熟材料受体,首先通过Sanger测序验证了3个基因靶标区域在4份玉米材料中的保守性,其次根据sgRNA设计原则选择了1个sgRNA复合编辑3个基因,并利用同源重组方法构建了将由胚特异性启动子Zm3896驱动的DsRed表达盒和由ZmU6-2启动子驱动的sgRNA表达盒串联的CRISPR/Cas9基因编辑敲除载体CCT-CPD,然后采用酶切法和Sanger测序法分析T0代KN5585中3个基因的突变率和突变类型,验证了该系统的基因编辑效果,最后通过对稳定遗传转化植株所结籽粒在籽粒水平、组织水平进行DsRed荧光标记表型鉴定,验证了该系统中DsRed荧光筛选标记的有效性。在此基础上,通过杂交育种法以晚熟材料为母本、以T1代KN5585阳性株为父本获得F1并经过DsRed荧光筛选获得含有有效编辑转基因元件的晚熟材料。本研究构建的编辑ZmCCT10/ZmCCT9/ZmGhd7基因的串联DsRed荧光表达盒的CRISPR/Cas9系统为创制单基因突变体,双基因突变体,三基因突变体奠定了基础,该系统中DsRed荧光筛选标记的应用可以快速筛选区分有无转基因成分的玉米籽粒,成本低,鉴定效率高,具有大规模籽粒筛选的潜力,本研究为鉴定ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7三个基因的功能和创制玉米光周期钝感材料奠定了材料基础和高效的技术基础。

基于CRISPR/LanCas9的水稻基因编辑系统的开发和优化

【目的】在水稻中建立CRISPR/LanCas9和CRISPR/SLanCas9基因编辑系统,扩展CRISPR/Cas基因编辑工具箱。【方法】将来自动物乳酸杆菌KCTC 3501的LanCas9进行密码子优化,并且进一步通过蛋白融合重组LanCas9和SpCas9的活性结构域形成嵌合体SLanCas9,分别构建CRISPR/LanCas9和CRISPR/SLanCas9编辑工具;以OsWRKY45、OsCPK4、OsCPK6、OsCPK7、OsMPK8、OsGSK3、OsGSK4为靶基因,在NGG PAM或者NAG PAM设计20 nt或者24 nt的sgRNA,通过水稻遗传转化,检测分析其编辑效率。【结果】LanCas9在水稻中可以识别NGG PAM,结合20 nt的sgRNA编辑效率更高,对OsWRKY45基因的编辑效率为25.00%;融合的SLanCas9不仅能够识别NGG PAM,在NAG PAM位点也有一定的编辑效率,在不同PAM位点的编辑效率分别可达100%和39.58%。此外,SLanCas9还具有多重基因编辑能力,在NGG PAM位点的多重基因编辑效率高达74.07%。【结论】开发了具有自主知识产权的新型CRISPR/LanCas9和CRISPR/SLanCas9基因编辑技术。

不同CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统的比较及优化研究

在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中。然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一。为提高CRISPR/Cas9系统介导的HDR效率,本团队及前人研究将不同接头蛋白与SpCas9蛋白融合表达,利用其与特异性DNA序列结合的特性,构建了多种CRISPR/SpCas9供体适配基因编辑系统。为了便于比较、优化不同CRISPR/Cas9供体适配系统,本研究利用这些系统在HEK293T细胞GAPDH和ACTB基因末位外显子3′-端进行了eGFP基因敲入,并采用了优化的供体DNA模板设计方式,通过PCR和Sanger测序检测敲入的准确性,流式细胞分析进行敲入效率的检测。结果表明,将yGal4BD、hGal4BD、hLacI、hTHAP11和N57等接头蛋白与SpCas9蛋白C-端融合对其活性均无显著性影响;在GAPDH位点上,SpCas9融合yGal4BD、hGal4BD、hLacI和hTHAP11的供体适配系统等均能显著提高敲入效率;在ACTB位点上,SpCas9融合yGal4BD和hGal4BD能显著提高敲入效率;且增加供体DNA模板中的结合序列(binding sequence,BS)数量,有利于提高SpCas9-hTHAP11系统介导的敲入效率。总之,本研究比较并优化了不同的CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统,为后续相关的基因编辑应用研究提供了参考和借鉴。

利用CRISPR/Cas9编辑系统构建ACTA1基因敲除的PEFs细胞系

【目的】利用CRISPR/Cas9技术获得α-肌动蛋白1(actin alpha 1,ACTA1)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryo fibroblasts, PEFs),为后续在细胞水平上探究猪ACTA1基因功能及发掘友好基因座位奠定基础。【方法】通过实时荧光定量PCR检测ACTA1基因在巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背部皮下脂肪和背最长肌7种组织中的表达情况;利用CRISPOR在线网站在猪ACTA1基因第7外显子区域设计3条向导RNA(single guide RNA,sgRNA),并将其连接至pX330载体;通过T7E1酶切检测不同sgRNA活性,选择效率较高且符合目标的载体质粒共转染至PEFs中;利用有限稀释法筛选单克隆细胞,并对获得的单克隆细胞进行基因型鉴定和脱靶分析。【结果】实时荧光定量PCR结果表明,ACTA1基因在背最长肌中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01)。设计的3条sgRNA的基因编辑效率分别为24.87%(sgRNA1)、39.59%(sgRNA2)、36.93%(sgRNA3),综合切割位置和基因编辑效率,选用sgRNA1和sgRNA2共转染细胞。基因型鉴定结果表明,获得的69株单克隆细胞中有20株单克隆细胞发生了编辑,其中单等位基因片段敲除细胞3株,双等位基因片段敲除细胞1株,片段敲除效率为5.8%(4/69)。脱靶分析结果显示,在预测的脱靶位点未检测到脱靶效应。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统成功构建了ACTA1基因纯合敲除的PEFs,研究结果为进一步探究ACTA1基因对猪骨骼肌发育调控提供了技术支撑和理论基础,同时为挖掘猪组织特异性表达的友好位点提供新思路。