一种基于HDR-CRISPR/Cas9技术快速构建重组鸭肠炎病毒的方法的建立

[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。

CRISPR/Cas9技术(递送)在支气管上皮细胞中的应用和进展

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)技术操作简易、高效,适用性强,在探究呼吸道潜在机制中具有独特优势。支气管上皮细胞是肺部防御的物理屏障,其损伤或功能缺失是慢性气道疾病的发病基础。近年来,慢性气道疾病发病率升高,但治疗进展相对缓慢,亟需找到治疗的突破口。CRISPR/Cas9系统可以进行精准基因编辑,为慢性气道疾病提供新策略。本文从CRISPR/Cas9的多种递送方式和作用机制出发,对其在原代、永生化支气管上皮细胞和动物体内的应用与进展进行概述,探讨了其发展前景和面临的挑战,以期为未来应用该技术进行气道疾病治疗提供参考。

CRISPR/Cas9技术在子宫内膜癌治疗中的研究进展

子宫内膜癌(endometrial cancer,EC)是全球第二常见的妇科恶性肿瘤。长期以来,对于患有晚期或复发性子宫内膜癌的患者,传统手术和放化疗治疗效果不甚明显,此为当前需要迫切解决的一大问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术可以通过精确修改基因组序列实现诱导基因组插入、缺失或碱基替换等功能,已在探索癌症的发生机制、潜在的治疗靶点以及癌症模型的构建等方面广泛应用,也为子宫内膜癌的临床研究提供了潜在致病靶点和新的治疗方案。该文主要围绕CRISPR/Cas9技术和其近年来在子宫内膜癌的相关研究进展做一综述。旨在为该领域的研究奠定基础,也为子宫内膜癌的临床治疗提供参考。

CRISPR/Cas9-introduced single and multiple mutagenesis in strawberry

CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for life science research. Recently, strawberry (Fragaria × ananassa), an important horticultural crop, has emerged as a model organism for investigating the regulatory mechanisms of fruit development and ripening (Shulaev et al., 2011; Jia et al., 2013, 2017; Kang et al., 2013; Han et al., 2015). While most cultivated strawberries

CRISPR/CAS9敲除PD-1的肿瘤浸润T淋巴细胞回输对小鼠结肠癌的治疗作用

目的:探讨应用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白(CRISPR/Cas9)技术敲除程序性死亡分子-1(PD-1)的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)回输对结肠癌小鼠的治疗作用。方法:皮下注射CT26构建小鼠结肠癌模型,从3只模型小鼠肿瘤组织中提取TIL,并提取外周血淋巴细胞;对TIL进行PD-1基因敲除;回输实验分为对照组(Control)、输注淋巴细胞组(Lym)、输注荷瘤小鼠TIL组(TIL)、慢病毒空载对照组(pVSV-G-PX458-NC)组、PX458-PD-1-sgRNA1组(PD-1-sgRNA1),每组10只;测量各组小鼠肿瘤组织质量及肿瘤抑制率;TUNEL法检测各组小鼠肿瘤组织细胞凋亡;ELISA检测各组小鼠肿瘤组织TNF-α和IFN-γ含量;免疫组化检测肿瘤组织CD4+T、CD8+T细胞表达;免疫荧光法检测肿瘤组织细胞增殖核抗原-67(Ki-67)和血管内皮生长因子(VEGF)表达;Western blot检测肿瘤组织PD-1及其主要配体PD-L1表达。结果:PD-1-sgRNA1能明显抑制小鼠肿瘤细胞体内生长,抑制肿瘤组织Ki-67和VEGF表达及PD-1、PD-L1表达,提高肿瘤组织细胞凋亡率、TNF-α、IFN-γ含量、CD4+T、CD8+T细胞表达(均P<0.05)。结论:CRISPR/CAS9敲除PD-1的TIL回输能明显抑制结肠癌小鼠肿瘤组织Ki-67和VEGF表达,增加CD4+T、CD8+T细胞,诱导肿瘤细胞凋亡,发挥抑制肿瘤生长作用。

利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体

培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值

本课题组前期在橡胶树原生质体中分别实现了基于CRISPR/Cas9-RNP及质粒介导的瞬时转化基因编辑,并以HbPDS基因为靶标,在橡胶树愈伤组织中实现了农杆菌介导的稳定转化基因编辑,并获得了出现白化表型的愈伤组织,但由于橡胶树愈伤诱导体胚的技术还不稳定,导致未能获得基因编辑植株。为了获得橡胶树基因编辑幼苗,本研究继续以HbPDS基因为靶标,改用橡胶树体胚为侵染受体,开展农杆菌介导的遗传转化,经潮霉素抗性筛选获得增殖的T_0代抗性体胚,通过Cas9基因分子检测共挑选出116个阳性转化体胚,通过对靶点处的测序检测发现有5个胚块发生了基因编辑,编辑效率为4.3%。通过植株再生程序,获得了2株再生植株,表型观测均是嵌合体,表现为同一编辑植株上同时存在绿色及白化叶片。同时取白化叶片和绿色叶片进行高通量测序,发现二者均已发生了基因编辑,除了1个白化叶片发生了纯合双等位突变之外,其余叶片均为嵌合突变。其中,白化叶片编辑细胞的占比介于86%~100%之间,而绿色部位编辑细胞所占比例介于66%~69%之间,说明橡胶树CRISPR/Cas9编辑植株出现预期表型的突变阈值高于69%,介于70%~85%之间,为今后创制有表型的橡胶树基因编辑幼苗提供理论指导。同时,本研究证明了T_0代转化体胚及其获得的再生植株嵌合比例太高,不宜作为植株再生的材料,为今后通过对T_0代阳性体胚进行继代获得T_1代纯合体胚,并以T_1代体胚为转化受体获得纯合基因编辑植株提供思路。本研究首次公开报道获得了橡胶树基因编辑植株,尽管是嵌合植株,但也增进了对CRISPR/Cas9在橡胶树中作用的理解,为下一步在橡胶树中改进并应用基因编辑技术奠定基础。

CRISPR/Cas9技术在热带作物育种中的应用研究进展

在热带地区种植的香蕉、番木瓜、甘蔗、木薯、天然橡胶、油棕等热带作物,是我国农业的重要组成部分,不仅为我们的日常生活和工农业生产提供了重要的原材料,而且为我国热带与亚热带地区的主要农业产量和经济增长做出了贡献。然而,这些作物的现代分子育种受其生物学特性和遗传复杂性的严重阻碍,多倍化、杂合性、无性繁殖、童期长和植株高大等问题导致热带作物的传统杂交育种周期长、难度大、进展慢。基因编辑技术的发展为热带作物育种带来了新途径和新机遇。CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术以其更高的靶向效率、多功能性和易用性,已被广泛应用于植物基因组编辑育种中。近年来,该技术在香蕉、木薯、天然橡胶、甘蔗等热带作物上也实现了广泛应用。本文介绍了基于CRISPR-Cas9系统的基因组编辑、CRISPR-Cas9在热带作物改良中的应用进展以及所面临的挑战和问题,同时对热带作物基因编辑育种方面提出建议,以期为后续研究提供思路,并为进一步开发应用该技术以有效改良热带作物的植物性状提供参考。

利用CRISPR/Cas9技术编辑OsOFP30基因创制水稻粒型突变体

【目的】研究水稻OFP家族转录因子OsOFP30对粒型的影响,创制新的粒型突变材料,为水稻粒型改良提供参考。【方法】以粳稻品种中花11为受体材料,利用CRISPR/Cas9技术对OsOFP30基因进行定向编辑;通过T_(0)、T_(1)和T_(2)代连续筛选,获得3类无外源片段插入的纯合突变体(长片段删除突变OsOFP30^(-89)、单碱基插入突变OsOFP30^(+1G)和OsOFP30^(+1A));分析粒型变异,进行生物信息学和测序分析,初步确定粒型变异原因。【结果】与野生型相比,3类突变体的粒宽和千粒重都显著降低,OsOFP30^(-89)和OsOFP30^(+1G)仅粒长和粒厚显著降低,穗型指标与野生型无明显差异,OsOFP30^(+1A)的粒长和粒厚与野生型无明显差异,仅一次枝梗数显著低于野生型;生物信息学分析表明,这3类突变体均由移码突变导致的翻译提前终止所产生,OsOFP30^(-89)突变蛋白长度为252个氨基酸,OsOFP30^(+1G)和OsOFP30^(+1A)突变蛋白长度均为282个氨基酸,两者仅第323位的核酸序列存在G和A的单碱基差异,导致突变蛋白第108位产生丝氨酸和天冬酰胺的差别。【结论】初步判断OsOFP30基因可调控水稻粒型变异。本研究创制了新的粒型突变材料,可为水稻粒型改良育种提供参考。

利用CRISPR/Cas9构建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因对心脏功能的影响

目的 应用CRISPR/Cas9技术构建蛋白磷酸2调节亚基B″家族α亚型(PPP2R3A)基因敲除小鼠,从分子水平及组织水平上研究PPP2R3A缺失对心脏的影响。方法 将Cas9 mRNA和两个靶向PPP2R3A第3外显子翻译起始密码子附近区域的单导向RNA微注射到C57BL/6小鼠受精卵中。小鼠出生后取其基因组DNA进行聚合酶链反应(PCR)和测序以鉴定基因型,鉴定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠为KO组,野生型C57BL/6小鼠为WT组(雄性3只,雌性2只)。小鼠心脏组织经甲醛固定并制成切片后分别进行苏木素-伊红(HE)染色和免疫组织化学染色。提取小鼠心脏组织总RNA和蛋白,应用荧光定量PCR和Western印迹验证基因敲除小鼠的有效性和检测互作蛋白表达。结果 获得F1代PPP2R3A杂合小鼠,PCR和测序结果表明突变小鼠的基因型存在113 bp的缺失突变。与WT组相比,KO组心脏组织中PPP2R3A mRNA和蛋白表达量明显下降(均P<0.05),参与心脏发育的G蛋白信号转导调控因子(RGS)19表达量明显升高(P<0.05)。PPP2R3A蛋白表达受损引起了心脏组织病理学变化。结论 PPP2R3A在体内可能通过与RGS19蛋白互作来参与心脏的发育并对心脏功能产生影响。

基于CRISPR/Cas9的棉花GhbHLH71基因编辑突变体的分析

碱性/螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,bHLH)转录因子在植物的生长发育、次生代谢、信号转导、逆境胁迫等方面起重要的调控作用。棉花GhbHLH71基因c DNA全长996 bp,编码331个氨基酸残基,蛋白序列中含有保守的bHLH结构域,属于bHLH转录因子家族成员。实时荧光定量分析结果表明,GhbHLH71基因在棉花纤维快速伸长期3~12 DPA (days post anthesis,DPA)相对高表达,暗示其主要在棉花纤维发育过程中发挥作用。构建该基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体进行了棉花遗传转化,T_0代再生株经过Cas9基因的PCR检测以及靶位点突变情况检测分析,获得6个T_0代基因编辑突变体。T_1代不同突变株系在棉花生长发育期的表型性状与对照相比无明显差异,但成熟纤维的长度与对照相比皆明显变短。T_2代突变株系可以稳定遗传T_1代株系纤维变短的表型。其中4#和8#株系连续2代的纤维长度与对照相比缩短比率皆达20%以上,表明GhbHLH71基因的突变主要影响了棉花纤维细胞的伸长。本研究为深入了解棉花中bHLH转录因子的生物学功能以及棉花纤维发育的分子机制提供了一定的参考。

CRISPR/Cas9技术在骨质疏松症领域应用的研究进展

骨质疏松症是成骨、破骨稳态失衡,骨基质矿化能力减弱的一种骨骼代谢疾病,患病人群逐年增多。CRISPR/Cas9技术可以在细胞及动物层面进行基因改造,为骨质疏松症领域的研究带来便利。本文就CRISPR/Cas9技术在影响成骨细胞、破骨细胞、巨噬细胞的功能以及介导Wnt、RANKL、BMP信号通路参与骨质疏松症发病研究领域的应用作一综述,为相关研究提供文献支持。

发根农杆菌介导的甜瓜CRISPR/Cas9系统靶位点的检测

选取甜瓜栽培材料龙庆八号作为受体材料,构建CmCURT1A基因CRISPR/Cas9基因编辑载体,经发根农杆菌介导检测靶位点的编辑情况,为后续甜瓜遗传转化试验提供载体基础。以甜瓜CmCURT1A基因(ID:MELO3C006053.2)为靶基因构建双靶位点敲除载体,经发根农杆菌K599介导的简单遗传转化技术使甜瓜组织长出不定根,经PCR测序发现在不定根中分别存在65 bp、72 bp不同碱基片段的缺失。该方法成功进行了甜瓜CRISPR/Cas9载体靶位点敲除情况的检测,简单高效,实现了在甜瓜中基因编辑靶点的快速鉴定,为研究甜瓜基因功能和遗传改良奠定基础。

酿酒酵母工业菌株中Ⅱ型启动子介导sgRNA表达的CRISPR/Cas9基因编辑系统的优化

CRISPR(clustered regulatory interspersed short palindromic repeat)系统因其高效、无痕、简便等特点已被广泛应用于生物基因编辑研究领域。就微生物基因编辑而言,该系统的研究主要集中于单倍体细胞的基因编辑操作。然而,对于遗传背景更为复杂的多倍体细胞来说,高效基因编辑系统的匮乏是制约工业菌株遗传改造及应用的关键因素。因此,以酿酒酵母二倍体工业菌株为研究对象,构建并系统优化了RNA PolⅡ(PolⅡ)和RNA PolⅢ(PolⅢ)两种启动子驱动sgRNA表达的CRISPR/Cas9基因编辑体系,同时对转化条件进行优化提高多位点基因编辑效率。研究结果表明,PolⅡ启动子可实现3对等位基因(即6个基因)一次性敲除,效率高达68%。随后也对目标基因多位点敲入进行了初步探索。该研究建立的酿酒酵母工业菌株CRISPR/Cas9基因编辑系统为菌株快速遗传改造提供强有力的技术支撑。

CRISPR/Cas9系统在畜禽遗传改良中研究进展

CRISPR/Cas9基因编辑技术作为一种高效的基因组编辑方法,在畜牧业遗传改良领域得到了广泛的应用。该技术以高效、精准的特点,为畜牧业发展带来了一场革命。目前,基于CRISPR/Cas9的基因敲除、基因敲入和基因修饰等已被广泛应用,实现了对畜禽物种的重要生产性状进行精准改良。本文介绍了CRISPR/Cas9技术的工作原理及发展历程,重点介绍了该技术在畜禽肌肉生长发育、绒毛纤维生长、乳品质成分、抗病育种以及动物福利中的研究进展,旨在为更深入地了解CRISPR/Cas9技术在畜禽基因编辑上的应用提供参考。

利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系

蛋白激酶D1 (protein kinase D1, PKD1;也称作PRKD1)是蛋白激酶家族成员之一,该家族由3种结构相关的应激激活酶组成,可调节机体多种生物学功能,主要涉及细胞增殖、分化、凋亡、免疫调节、心脏收缩、血管生成和癌症等,其中PRKD1与心脏肥大、收缩和缺血再灌注损伤的底物磷酸化有关。相关研究报道,先天性心脏病患者存在PRKD1基因突变,但其在心脏中的特异性功能和分子机制并未阐明。为了便于后期研究PRKD1基因在人类早期心脏发育的作用机制,本文拟利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼prkd1基因敲除品系。首先,通过生物信息学网站筛选出两个最佳的基因敲除靶位点,合成相应靶位点的单链向导RNA (single guide RNA,sg RNA)和引物;然后,将两个靶位点的sg RNA进行体外转录,并将其与Cas9蛋白混合后共同注射到斑马鱼的1-细胞期;最后,对基因敲除后的F0、F1、F2及F3代斑马鱼的胚胎和成鱼进行有效性鉴定及表型观察。结果显示,靶位点附近出现了不同程度的碱基缺失;成功构建了F1代能够稳定遗传的prkd1基因敲除的3个亚系;与野生型相比, F3代纯合子胚胎表现出不同程度的心腔膨大、环化异常及心管线性化等畸形现象。综上可知,本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼prkd1基因敲除品系,为进一步研究该基因在人类心脏发育中的特异性功能提供了有益参考,并为后期的先天性心脏病筛查和精准医疗提供了重要依据。

CRISPR/Cas9技术高效制备山羊SOCS2基因编辑胚胎

旨在设计、筛选高效编辑山羊胚胎生长负调控因子SOCS2基因的sgRNA,为通过SOCS2基因编辑创制快长型山羊奠定技术基础。本研究利用在线网站对山羊SOCS2基因SH2结构域保守序列设计2条sgRNA,构建表达载体,体外转录获得sgRNA及Cas9 mRNA;体外检测sgRNA+Cas9蛋白切割靶DNA的效率;在此基础上将屠宰场山羊卵巢分离培养的442个孤雌胚胎进行分组,2个试验组显微注射sgRNA和Cas9 mRNA混合物,对照组注射超纯水,以单个囊胚全基因组DNA扩增产物为模板,PCR扩增靶区域并测序鉴定,发生编辑的样本进行T-A克隆测序检测编辑形式;根据在线网站预测,每条sgRNA选择5个错配数最少的潜在脱靶位点进行脱靶检测。结果表明,在SOCS2基因83和96号氨基酸密码子附近区域获得2条sgRNA并成功构建表达载体,体外转录获得高质量sgRNA和Cas 9 mRNA;两条sgRNA均可引导Cas9蛋白在体外完全切割靶DNA;SOCS2-sg-83对胚胎的编辑效率为94.1%,160个T-A克隆中有152个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为95.0%,其中81.3%发生了移码突变,9.4%的克隆缺失83号氨基酸密码子,累计90.6%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除;SOCS2-sg-96对胚胎的编辑效率为50.0%,80个T-A克隆中有70个在靶位点出现插入、缺失或替换,概率为87.5%,移码突变概率为75.0%,5.0%的克隆缺失了96号氨基酸密码子,累计80.0%的克隆实现了SOCS2基因功能性敲除。另外,在所有已编辑胚胎中均未发现脱靶。综上,SOCS2-sg-83可实现山羊胚胎SOCS2基因的高效、精准编辑和敲除,为高效制备SOCS2基因敲除山羊,培育快长型肉用山羊奠定了技术基础。

利用CRISPR/Cas9技术编辑GmBADH1基因改变大豆耐盐性

耐盐基因功能鉴定对于大豆品种改良以及盐碱地的开发利用至关重要。盐害胁迫下作物通过合成和积累甜菜碱作为渗透保护剂,减小盐害对作物产量的影响。BADH基因已在多种植物中被证实调节植物对逆境胁迫的响应,但在大豆中的调控机制尚不清晰。本研究克隆了GmBADH1基因,qRT-PCR显示该基因在根、茎、叶中均有表达,尤其在根中的表达丰度最高。通过农杆菌介导的大豆遗传转化技术将CRISPR/Cas9系统构建的表达载体转入到大豆品种JACK中,产生了3种可以调控大豆耐盐性状的靶向突变,均发生在编码区,分别为缺失19 bp、插入1 bp、插入9bp替换2 bp。前两者,过早出现的终止密码子,使其均产生截断的BADH1蛋白,后者发生移码突变。在出苗期和苗期分别对突变纯合植株进行盐处理,结果表明,出苗期耐盐性与野生型相比显著下降,苗期与野生型相比无明显差异。这说明GmBADH1基因可能主要调控出苗期的耐盐性状。本研究为深入挖掘大豆耐盐基因和培育大豆耐盐品种提供了依据。

编辑ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因的串联DsRed荧光表达盒的CRISPR/Cas9系统的构建及验证

CCT家族基因影响植物开花,在玉米中,ZmCCT10、ZmCCT9基因是光周期敏感基因,ZmGhd7基因是与开花期相关的基因。利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因为研究基因的功能和快速改良玉米的开花期提供了可能。本研究以玉米ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7基因为编辑对象,以KN5585为稳定转化受体、以CML312SR、LCL-1、LCL-2为预改良的晚熟材料受体,首先通过Sanger测序验证了3个基因靶标区域在4份玉米材料中的保守性,其次根据sgRNA设计原则选择了1个sgRNA复合编辑3个基因,并利用同源重组方法构建了将由胚特异性启动子Zm3896驱动的DsRed表达盒和由ZmU6-2启动子驱动的sgRNA表达盒串联的CRISPR/Cas9基因编辑敲除载体CCT-CPD,然后采用酶切法和Sanger测序法分析T0代KN5585中3个基因的突变率和突变类型,验证了该系统的基因编辑效果,最后通过对稳定遗传转化植株所结籽粒在籽粒水平、组织水平进行DsRed荧光标记表型鉴定,验证了该系统中DsRed荧光筛选标记的有效性。在此基础上,通过杂交育种法以晚熟材料为母本、以T1代KN5585阳性株为父本获得F1并经过DsRed荧光筛选获得含有有效编辑转基因元件的晚熟材料。本研究构建的编辑ZmCCT10/ZmCCT9/ZmGhd7基因的串联DsRed荧光表达盒的CRISPR/Cas9系统为创制单基因突变体,双基因突变体,三基因突变体奠定了基础,该系统中DsRed荧光筛选标记的应用可以快速筛选区分有无转基因成分的玉米籽粒,成本低,鉴定效率高,具有大规模籽粒筛选的潜力,本研究为鉴定ZmCCT10、ZmCCT9、ZmGhd7三个基因的功能和创制玉米光周期钝感材料奠定了材料基础和高效的技术基础。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用研究进展

基因编辑技术是一种对目的基因进行特定修饰的技术,被广泛应用于生物育种、疾病模型构建等研究领域。CRISPR/Cas9系统由重复和间隔单元组成的CRISPR阵列和一个Cas基因座位组成,能够对生物体性状进行目的基因定点编辑,具有简单、精确且高效的特点。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过引入基因敲除、基因敲入、缺失、点突变和单核苷酸突变等不同形式的修饰广泛应用于畜禽的基因编辑,以研究畜禽关键基因功能,从而加速性状改良。相较于猪、鸡等其他畜禽,CRISPR/Cas9技术对羊的研究相对滞后。文章重点阐述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用,对其在产肉性状、纤维性状、泌乳性状和人类疾病模型等方面的应用研究进展及前景进行了简要概述,以期为我国羊产业的可持续发展提供参考。