基于CRISPR/Cas13a系统的发热伴血小板减少综合征病毒快速检测方法的建立

目的建立基于CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR)系统的快速、灵敏的现场发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)核酸检测方法。方法首先,经序列比对分析得到SFTSV S基因特异性保守区,设计并筛选多酶恒温扩增(multienzyme isothermal rapid amplification,MIRA)引物和靶标CRISPR RNA(CRISPR RNA,crRNA),经荧光信号和免疫层析试纸读取检测结果。为提升检测敏感度在单反应体系中加入多个检测靶标crRNA。并利用蜱感染模拟样本和蜱源样本验证该方法对蜱样本现场核酸检测的有效性。结果MIRA-CRISPR/Cas13a荧光法检测SFTSV的最低检测限为1 copy/μL,试纸法的最低检测限为10 copies/μL。特异性实验表明SFTSV与其他4种阴性对照病原均无交叉反应。该方法检测蜱感染模拟样本的灵敏度优于RT-PCR法。应用所建立的方法检测29份蜱源SFTSV样本,共检出20份阳性样本和9份阴性样本,与RT-PCR检测结果符合率为100%。结论本文所建立的方法可用于SFTSV的现场快速检测。

猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合,即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明,该方法最低可检测至101 copies·μL^(-1),且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13a方法灵敏度高、特异性强,为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段。

重组酶辅助扩增结合CRISPR/Cas13a检测禽腺病毒4型方法的建立

【目的】建立高效、灵敏、特异的禽腺病毒4型(fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4)检测方法。【方法】将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated protein 13a,CRISPR-Cas13a)技术相结合,针对FAdV-4 Hexon基因保守区设计RAA引物及CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行CRISPR-Cas13a荧光检测,以qPCR为对照方法,评价所建立方法的灵敏度、特异性以及与qPCR法的一致性。【结果】本研究所建立的方法反应过程均在37℃恒温条件下完成,反应体系可检测的最低扩增拷贝数为101 copies/μL,灵敏度高,且与FAdV-1、FAdV-7、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、鸡传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感H9亚型疫苗和新城疫病毒等禽病原核酸检测无交叉反应。该方法检测30份临床样本与qPCR检测的阳性检出率一致。【结论】建立的RAA-Cas13a方法检测FAdV-4具有简便、灵敏、特异等特点,可用于FAdV-4的快速检测和流行病学监测。

K亚群禽白血病病毒CRISPR/Cas13a检测方法的建立及初步应用

为了快速、准确和简便地检测K亚群禽白血病病毒(ALV-K),本研究参照GenBank中ALV-K的gp85基因设计了特异的RPA引物和用于LwCas13a反应系统的crRNA,通过优化反应条件建立了检测ALV-K的CRISPR/Cas13a方法,并验证了该方法的特异性、敏感性和符合性。结果显示,该法对感染鸡的其他常见病毒的检测均为阴性,特异性良好无交叉反应;灵敏度为50 copies/μL;与PCR的检测结果有很好的符合性。本研究建立的CRISPR/Cas13a检测方法配合试纸条显色在1.5 h左右可对ALV-K进行快速的鉴别诊断,为该病的诊断及防控净化提供了强有力的技术支撑。

基于CRISPR/Cas9技术验证人T淋巴细胞中单等位突变型UNC13D基因脱颗粒功能

目的利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,敲除人T淋巴细胞中编码Munc13-4蛋白的UNC13D基因;并探讨突变型UNC13D基因(c.1232 G>A,p.R411Q)对人T淋巴细胞Munc13-4蛋白和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)脱颗粒功能的影响。方法设计靶向敲除UNC13D基因的sgRNA序列,构建CRISPR/Cas9 UNC13D-sgRNA共表达质粒,筛选出切割效率较高的sgRNA通过第二代慢病毒包装系统包装慢病毒并感染人T淋巴细胞,再将已包装好的野生型以及突变型UNC13D慢病毒感染knockout-UNC13D基因的人T淋巴细胞,以此分为野生型与突变型两组,应用流式细胞术检测两组间的Munc13-4蛋白表达、CTL的脱颗粒功能。结果成功构建出CRISPR/Cas9 UNC13D-sgRNA共表达质粒,CRISPR/Cas9系统成功下调人T淋巴细胞Munc13-4蛋白表达水平;突变型UNC13D基因(c.1232 G>A,p.R411Q)编码的蛋白能够使人CTL脱颗粒功能下降。结论CRISPR/Cas9基因编辑系统成功敲除人T淋巴细胞UNC13D基因,突变型UNC13D基因(c.1232 G>A,p.R411Q)可能为家族性噬血细胞综合征(FHL)的致病性突变位点。

分子诊断及疾病治疗的新工具:CRISPR/cas13系统

规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关蛋白(CAS)系统已在基因编辑邻域掀起一波热潮,相比已研究成熟CRISPR/cas9系统,CRISPR/cas13系统作为一种新型的RNA编辑工具,开启了RNA水平研究及诊疗的新时代。CRISPR/cas13系统在CRISPR RNA(cr RNA)的引导下可以特异性切割靶序列,同时能对周边RNA进行非特异性的“附带切割”,基于该CRISPR/cas13系统的特性,通过优化与改造,CRISPR/cas13系统已成为分子诊断及疾病治疗的新工具。本文对CRISPR/cas13系统的特点及分子机制进行总结,并对其在分子诊断、疾病治疗等方面的研究进展进行综合论述。

与众不同的核酸酶Cas13a:编辑RNA的新CRISPR平台及其进展

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,规律成簇的间隔短回文重复)平台是出色的基因组编辑工具,其中新型核酸酶Cas13a(CRISPR-associated protein 13a)既可编辑DNA,也可编辑RNA,这一新平台可实现DNA或RNA的摩尔灵敏度以及单碱基错配的特异性检测,同时拓展用于病毒与细菌的精细检测(甚至是寨卡与登革热的近亲病毒株)、癌症早期监测和遗传性疾病等治疗;其需要设计少,技术操作简单,具有广泛的应用潜力,是基因组编辑的又一项卓越成果。综述了Cas13a系统的最新进展。

CRISPR/Cas9介导的猪IPEC-J2细胞CD13基因敲除细胞系的建立

旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13,CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA,gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。

应用CRISPR/Cas13a快速鉴定布鲁氏菌

目的建立一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法。方法以布鲁氏菌BCSP31基因的保守区为靶标区域设计特异的引物和crRNA,建立鉴定布鲁氏菌的CRISPR/Cas13a方法。通过对纯菌株以及临床需氧血培养阳性菌液检测评价该方法的特异性和敏感性;通过梯度稀释法评估其检测下限。结果建立了基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌快速鉴定方法,其检测下限可达10 fg/μL。通过鉴定64株布鲁氏菌、56株非布鲁氏菌、人DNA以及57例临床需氧血培养阳性菌液,计算该方法的敏感性、特异性可达100%。结论建立了一种基于CRISPR/Cas13a的布鲁氏菌鉴定方法,可用于临床需氧血培养阳性后快速鉴定布鲁氏菌。

CRISPR/Cas13a重组蛋白表达纯化及其连带剪切酶活性的鉴定

为建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,在大肠杆菌中表达LwaCas13a重组蛋白,并对其连带剪切酶活性进行鉴定。将重组质粒pET His6-TwinStrep-SUMO-LwaCas13a转化至Rosetta(DE3)感受态细胞诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot分析结果显示,成功表达了可溶性LwaCas13a重组蛋白。对诱导温度和时间进行优化,结果显示,在16℃条件下诱导培养15 h时,LwaCas13a重组蛋白的可溶性表达量最高。通过镍柱亲和层析法对表达的LwaCas13a重组蛋白进行纯化,得到单一的目的条带,纯化效果较为理想。此外,通过体外转录合成了1对CRISPR RNA及靶标RNA,建立LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法,可在37℃条件下30 min内完成检测,对靶标RNA的检出限为31.2 nmol/L。综上,成功利用大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株可溶性表达了LwaCas13a重组蛋白,且纯化后的LwaCas13a重组蛋白具有良好的连带剪切酶活性,建立了LwaCas13a连带剪切酶活性的检测方法。

应用CRISPR/Cas13b编辑技术治疗TNNT2R141W转基因小鼠的扩张型心肌病

应用CRISPR/Cas13b系统对TNNT2R141W转基因扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)小鼠进行探索性治疗,尝试发现治疗扩张型心肌病的一种新方式,为CRISPR/Cas13b系统在体内应用提供实验基础。随机设计11种Cas13b-TNNT2 gRNA并成功构建表达质粒,把它和人源TNNT2过表达质粒共同转染到293T细胞中,通过实时定量PCR(Q-PCR)检测人源TNNT2 mRNA的表达水平。结果显示,gRNA2引导Cas13b敲低目标基因的效率最高,达到80%(P<0.0001)。把gRNA2表达质粒包装到慢病毒载体中,转导出生后1 d的DCM小鼠原代心肌细胞。Q-PCR检测结果表明,CRISPR/Cas13b系统对人源TNNT2 mRNA敲低效率达到55%(P<0.01)。把PspCas13b和gRNA2的表达载体分别包装到AAV9病毒载体中,再将200μL约1×1012AAV9病毒颗粒通过尾静脉注射到4月龄DCM小鼠体内,待注射小鼠发育至5月龄时。Q-PCR检测结果显示,AAV9+DCM组TNNT2R141W表达水平较未注射组对照明显下降至40%(P<0.01)。对5月龄野生型(WT)、DCM(未注射病毒组)和AAV9+DCM(基因组编辑工具注射组)三组小鼠的心脏形态、心功能、心肌纤维化和心力衰竭等表型的观察结合显示:DCM小鼠的心血管形态异常,而AAV9+DCM小鼠心血管形态趋于正常。对3组小鼠的心脏进行超声心动图,并对心功能指标进行统计发现,DCM组较WT组小鼠的左心室射血分数(left ventricular percent ejection fraction,LV EF%)、左心室短轴缩短率(left ventricular percent fractional shortening,LV FS%)分别下降50.4%(P<0.0001),55.1%(P<0.0001),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠的LV EF%、LV FS%分别上升66.5%(P<0.01),77.0%(P<0.01)。通过Q-PCR和天狼星红染色检测3组小鼠的心肌纤维化程度。结果显示,DCM组较WT组小鼠的Col3a1和Postn两种纤维化基因,分别高表达5.2倍(P<0.001)、4.5倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠两种基因表达分别下降2.0倍(P<0.05)、1.4倍(NS)。天狼星红染色结果显示,纤维化区域明显下降;通过Q-PCR和蛋白质免疫印迹分别检测3组小鼠的心肌心力衰竭基因Nppb mRNA和Nppa蛋白质的表达水平。结果表明,DCM组较WT组小鼠Nppb mRNA表达上升14.2倍(P<0.01),而AAV9+DCM组较DCM组小鼠Nppb mRNA表达明显下降2.8倍(P<0.05),Nppa蛋白表达趋势与Nppb相同。把gRNA 5和含有R141W突变(gRNA 5T),以及正常的TNNT2 mRNA(gRNA 5V)序列分别组合转染到293T细胞中。通过Q-PCR检测两种序列mRNA的表达水平。结果显示,gRNA 5T序列表达效率为30%(P<0.0001),而并未检测到gRNA 5V mRNA的敲低。本研究通过设计靶向TNNT2R141WmRNA的gRNA,特异性敲低TNNT2R141W转基因小鼠体内突变的mRNA,有效改善了转基因小鼠的心功能,为临床进一步探索扩张型心肌病的治疗奠定了实验室基础。

RNA靶向系统Crispr/Cas13在分子诊断及临床治疗中的研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, Crispr)/Crispr相关蛋白(Crispr-associated proteins, Cas)系统彻底变革了基因编辑和基因表达的方式,其中靶向切割DNA特定位点的Crispr/Cas9系统的研究日趋成熟,而目前靶向切割RNA的Crispr/Cas13系统研究较少。Cas13由crRNA(Crispr RNA, crRNA)引导,特异性识别靶向RNA片段,激活后特异性剪切靶向片段,随后对附近的RNA片段进行无差别的"附带剪切",在分子诊断及个体化治疗上具有广阔的应用前景。该文主要对靶向RNA的Crispr/Cas13系统的作用特点及机制进行阐述,并对在临床分子诊断及疾病治疗中的研究进展进行综述。

CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用

【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。

CRISPR/Cas13a系统在大肠杆菌RNA编辑过程中的逃逸现象

【目的】在大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655-ΔrecA和Escherichia coli DH10B中构建CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统,通过靶向非必需基因lacZ和必需基因polA,分别分析RNA编辑实验中的逃逸现象。【方法】选取来自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的Cas13a蛋白编码基因LshCas13a,构建可诱导的CRISPR/LshCas13a的RNA编辑系统相关质粒,选取MG1655-ΔrecA和DH10B为研究对象。通过Crisporo算法,设计靶向lacZ和polA的CRISPR RNA(crRNA)序列,考察利用LshCas13a质粒干扰实验靶向lacZ和polA的逃逸现象。再通过对逃逸菌落的数量和序列分析评估LshCas13a系统的逃逸现象,结合PCR和Sanger测序技术探究LshCas13a系统的逃逸事件。选取通过插入序列(insertion sequence,IS)转座破坏LshCas13a系统的LshCas13a基因的逃逸菌落,通过监测OD_(600)进一步考察菌株的生长情况。【结果】利用LshCas13a系统靶向MG1655-ΔrecA和DH10B中的lacZ和polA,发现靶向lacZ时,MG1655-ΔrecA通过LshCas13a基因点突变和IS转座突变方式逃逸;靶向polA时,MG1655-ΔrecA和DH10B通过点突变LshCas13a基因、IS转座和突变crRNA的直接重复(direct repeat,DR)序列等方式逃逸。LshCas13a编码基因的突变促进了菌株生长的恢复。【结论】本研究利用LshCas13a质粒干扰系统研究了E.coli宿主RNA编辑中的多样化逃逸现象,包括了染色体编码的IS介导的LshCas13a转座突变、LshCas13a点突变、crRNA的DR序列突变或重组等情况。本研究为进一步优化CRISPR/LshCas13a基因编辑系统奠定了基础。

基于CRISPR/Cas13a技术检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的研究

目的:建立一种基于CRISPR/Cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crRNA长度和浓度进行优化,初步建立基于CRISPR/Cas13a的R248W变异体快速检测方法;利用不同突变率TP53 R248W变异体及模拟血浆ctDNA,评价CRISPR/Cas13a方法的检测灵敏度。结果:建立的CRISPR/Cas13a方法成功检测出产物大小为368 bp的TP53R248W片段;在0.05~0.25μmol/L浓度范围内,crRNA浓度越高,检测结果相对荧光值越高;该方法检测TP53 R248W变异体的灵敏度为1×10~4拷贝/μL,最低可以检测出突变率为0.01%的变异体。结论:建立的CRISPR/Cas13a方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点,为组织和血浆中的TP53 R248W变异体的检测提供了新的技术手段。

核酸检测和基因编辑的新工具:CRISPR/Cas13系统

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins, Cas)系统是目前基因编辑、基因表达研究的热点,其中,研究较成熟的为CRISPR/Cas9系统,其在单链RNA的引导下可特异地切割靶DNA的特定位点,实现DNA水平的操作。而靶向RNA的CRISPR/Cas13系统开启了在RNA水平研究、诊疗的新时代。活化的Cas13具有独特的核酸酶活性,可特异性地切割靶向RNA,同时非特异性地切割周围环境中的RNA,利用以上特性可实现体外核酸检测。通过活性位点突变可产生无核酸酶活性但可与RNA结合的dCas13(dead Cas13),将dCas13与其他功能性蛋白质进行融合可进一步扩大dCas13的应用范围。该文主要概括了CRISPR/Cas13系统在核酸检测以及在RNA水平作为基因编辑工具的新进展。

基于CRISPR/Cas13的RNA编辑系统及其在核酸检测中的应用

核酸检测技术在农业、医药、环境等多个领域均有广泛应用,传统的核酸检测技术存在设备昂贵、操作复杂和灵敏度低等诸多局限性。成簇规律间隔短回文重复序列及其相关基因13(CRISPR/Cas13)是一种只靶向RNA的新型CRISPR系统,能在CRISPR RNA(crRNA)引导下特异切割单链靶RNA,并有非特异性的“附带切割”能力。基于CRISPR/Cas13的核酸检测技术具有灵敏度高、特异性强、操作方便、成本低廉等优点,具有广阔的应用前景。阐述了CRISPR/Cas13系统的类别归属及其亚型,组分特征及其分子作用机制,介绍了基于CRISPR/Cas13系统的特异性高灵敏度酶报告解锁(SHERLOCK)技术的产生和发展,综述了CRISPR/Cas13系统在病原体检测、耐药突变检测、物种识别和转基因鉴定方面的应用,同时指出了目前基于CRISPR/Cas13核酸检测技术存在的问题,并对未来应用进行了展望。

CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降

研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞(PEF)中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降,从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs,并以单链寡核苷酸的形式合成,退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接,构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体,用Sanger软件进行测序;将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞,48 h后收集细胞,用流式细胞术分选检测细胞转染效率,用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率;用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后,靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明,针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中;流式细胞术分选结果显示,转染效率约70%;半定量PCR结果表明,与对照组相比,3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达(P<0.01),其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%;Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组;实时荧光定量PCR结果表明,Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组(P<0.05),且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高(70%)。半定量PCR结果显示,转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达,表达量为对照组的25%~30%(P<0.01)。免疫荧光检测结果表明,敲降SUV39H1和SUV39H2基因后,组蛋白H3K9me3水平显著降低(P<0.05)。因此,本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2,并下调其催化的H3K9me3水平。

基于RAA-CRISPR/Cas13a的禽流感病毒检测方法的建立

对NCBI文库公布的120条不同亚型禽流感病毒的M基因序列进行分析,筛选得到一处高保守片段并进行重组酶介导等温核酸扩增(recombinase-aided amplification,RAA)引物和crRNA的设计。待测样品先进行RAA核酸扩增,再将扩增产物转移至有规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/Cas13a检测体系中,通过监测该体系中荧光值的变化情况进行结果判定。使用梯度稀释(10^(6)~10^(0)拷贝/μL)的标准阳性质粒以及其他7种禽病病毒验证方法的灵敏度和特异性,并利用本试验所建方法和国标荧光RT-PCR方法对50份临床样品(21份阳性样品、29份阴性样品)进行检测以评价方法的检测性能。结果显示,本试验建立的检测方法灵敏度为10~2拷贝/μL,较普通RAA方法灵敏度提高了2个数量级;能特异性检出AIV,不与NDV、IBV、ILTV、IBDV、ALV、AMPV、AAV-1发生交叉反应;与国标荧光RT-PCR方法相比,该方法检测的特异性、准确性和一致性分别为100%、95.24%和98.00%。结果表明,本试验建立了检测AIV通用型的RAA-CRISPR/Cas13a快速诊断技术,其在37℃条件下60 min内即可完成检测,具有快速、灵敏、特异等优势,为AIV的现场快速检测提供了手段。

利用CRISPR/Cas13a编辑技术获得马铃薯抗PVX植株

为探究利用CRISPR/Cas13a系统获得抗马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)马铃薯的可行性,通过设计靶向PVX中TGBp1基因的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建CRISPR/Cas13a基因编辑载体,以马铃薯栽培种Désirée为受体材料进行稳定遗传转化,并通过机械摩擦接种法鉴定转基因植株对PVX的抗性。结果显示,成功构建了靶向PVX的PVX-Cas13a载体,并获得了表达Cas13a的转基因马铃薯植株,对其中3个高表达Cas13a的株系进行PVX抗性鉴定,发现在接种PVX 10~20 d后,转基因植株系统叶上无明显发病症状,且PVX积累量均显著低于未接种PVX对照。表明靶向PVX的CRISPR/Cas13a系统能够有效抑制该病毒的积累,这为马铃薯抗PVX育种提供了一条有效策略。