CRISPR/Cas9系统活细胞成像技术进展(特邀)

CRISPR/Cas9系统因其高效、操作简便、物种适应性广等优势被广泛应用于基因编辑领域,该系统是由靶向目标DNA序列的引导RNA(sgRNA)和具有切割酶活性的Cas9蛋白组成。近年来,通过将核酸酶失活的Cas9突变体dCas9(dead Cas9)或sgRNA与荧光蛋白(FPs)、有机染料、量子点(QDs)结合开发出一系列超分辨活细胞成像技术,该技术有助于在更高分辨率下研究不同基因、染色体以及基因与染色体之间的时空关系,对促进遗传学、细胞生物学和生物医学等领域的快速发展具有重要意义。文中主要总结基于CRISPR/Cas9系统的活细胞成像技术的最新进展,有望进一步扩大活细胞成像技术在生物医学领域的广泛应用。

活体生物发光与荧光成像技术在干细胞研究中的应用

活体生物发光与荧光成像技术是近年发展起来的新兴技术,以其操作简便、灵敏度高、创伤性小在生命科学研究中有着较大的优势,目前已被广泛应用于基因标记、细胞凋亡、免疫细胞研究、肿瘤转移等诸多领域,尤其在新兴的干细胞研究方面更是发挥着不可替代的作用。综述了活体生物发光与荧光成像技术的原理、优势、应用范围及发展前景,特别对近年来该技术在胚胎干细胞的肝向分化、人造血干细胞重建小鼠造血系统、神经祖细胞治疗中枢神经系统肿瘤等方面的应用做了详细介绍。

活细胞荧光成像技术连续观察胶质瘤干细胞向内皮细胞分化过程中多种分子标记物的变化

目的采用活细胞荧光成像技术动态观察胶质瘤干细胞向内皮细胞的分化过程,并分析细胞表面标记物的变化。方法以胶质瘤干细胞株GSC-1为对象,分别进行免疫荧光标记技术和活细胞荧光成像技术观察其在分化过程中分子标记物的变化趋势。结果 GSC-1置入三维培养基质,细胞随时间增加而增殖,6 h后,细胞突起发生融合,细胞增殖,可清晰地观察到多细胞所形成的圆形、多边形和三角形管道样结构。VEGF诱导下免疫荧光染色观察GSC-1表达CD34随时间增加而增加,6 h时较多GSC-l细胞表达CD34,出现典型的闭合样管腔结构。CD34阳性细胞数间差异存在统计学意义(P<0.05)。活细胞荧光观察追踪单个细胞发现,6 h达到高峰,CD34阴性细胞逐渐出现绿色荧光,提示转变成CD34阳性细胞。结论活细胞荧光成像技术观察结果同传统免疫荧光技术所得到的结果相一致,同时可获得单个细胞从CD34阴性细胞转变为CD34阳性细胞的直接影像证据,可直观、准确地对单个细胞进行追踪。

活细胞成像中的光学显微技术

自细胞结构的早期检查起,利用光学显微技术观察细胞一直使生物学家们入迷。荧光标记技术的出现,以及丰富的精密光学显微镜技术使得活细胞中动态过程的研究变得普遍。但是,对于不大了解这个领域的研究者,使用哪种技术或仪器会比较难以决定。这里,我们对活细胞成像的主要方法给出一个简单的回顾,并指出它们的优点和缺点。

CRISPR/Cas系统在活细胞染色体成像中的应用

CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated Proteins)是细菌抵抗外来入侵的一种自适应免疫机制,利用CRISPR/Cas9系统可实现双链DNA的剪切并诱导宿主细胞DNA修复机制,从而达到靶向编辑基因的目的。核酸酶失活的Cas9(Nuclease-deactivated Cas9,d Cas9)耦联效应分子可以调控靶标结合位点附近基因的表达、表观遗传修饰及特异染色体区域标记。目前已开发出多种CRISPR/Cas9系统,可对活细胞中重复或低重复序列基因位点进行实时多位点同步成像,广泛应用于动物和植物细胞中。基于CRISPR/Cas系统的活细胞染色体成像技术为研究活细胞染色体动力学和三维染色体结构提供了全新角度。本研究针对CRISPR/Cas系统的生源机制及其在活细胞成像的应用和发展现状进行概述,以期为该领域的相关研究提供参考。

基于热可逆水凝胶包埋技术的活细胞、模型生物体、寄生动物的高容量成像

活体生物、组织切片、肿瘤球状体以及细胞,往往由于其具有很高的能动性或受布朗运动的支配,因此对高容量成像方面提出了特殊的要求,通常难以实现高分辨率的成像。科学家们试图采用黏附表面和固定化基体(如低熔点的琼脂糖和甲基纤维素)的方法来克服这些问题,但是这些技术也存在一些缺陷,通常并不适用于处理活体生物和细胞。为了解决这些问题,CyGELTM和CyGEL持续热可逆水凝胶封固剂得以开发,并为高级显微技术的发展提供思路。

北大研究团队开发活细胞成像新技术

北京大学生命科学院生物动态光学成像中心、工学院黄岩谊课题组与化学学院陈兴课题组合作开发了一种全新的活细胞成像技术,利用炔基标记手段并巧妙应用受激拉曼显微成像技术,成功实现了对活细胞的脂类、核酸、蛋白质和糖类等关键生物分子的特异性、低干扰的三维成像,突破了成像标记基团的尺寸极限。

原子力显微镜对生理溶液中活细胞成像条件的研究

本文研究用原子力显微技术(AFM)在生理条件下对活细胞成像的基本方法,并对各种影响成像因素如针尖与细胞表面的非特异性相互作用、AFM悬臂弹性系数及细胞表面柔性等问题提供相应的解决方案。从而为AFM在成像的基础上对活细胞其它性质的研究提供基础。用本文方法清晰地显示了固定细胞与活细胞膜表面所具有的明显差别:活细胞膜完整平滑,固定细胞表面粗糙,边缘不整。

新型成像技术让人类看清活细胞内任何活动

美国麻省理工学院的科学家近期宣布，运用类似X光CT扫描的方法，他们开发出一种新型成像技术，可在不用荧光标记或其他外加对比试剂的情况下展现活细胞内的任何活动。该技术使人类首次能够对活体细胞在自然状态下的各种功能加以研究。

活体光学成像技术在眼科学领域的应用前景

活体光学成像技术是一种可实时动态观察生物生物学行为的影像学技术,目前已经应用于生命科学的各个方面,如干细胞治疗、肿瘤研究和药物研究等。该技术在眼科学领域也有很大的应用潜力。现对活体光学成像技术的应用现状作一总结,并展望其在眼科学领域的应用前景。

顺铂联合长春新碱对HCT-8/V肿瘤细胞耐药逆转的实时动态活细胞成像研究

目的:探讨顺铂(DDP)联合长春新碱(VCR)对人结直肠腺癌耐长春新碱细胞(HCT-8/V)增殖、凋亡与自噬的影响。方法:以RT-LCI高内涵技术平台,连续观察120 HCT-8/V细胞的生长规律及连续70 h观察细胞凋亡与自噬。结果:DDP对HCT-8/V有抑制作用,但无剂量依赖关系; VCR对HCT-8/V抑制作用与药物浓度梯度呈正比; DDP、VCR对细胞凋亡的影响没有差异; DDP、VCR单独及联合应用可抑制HCT-8/V自噬。结论:DDP联合VCR应用通过抑制HCT-8/V细胞的增殖与自噬实现耐药性逆转。

发展适用于活体细胞中RNA分析和成像的新型分子信标

很多研究采用分子信标技术来作为活体细胞中RNA表达研究的成像手段。然而,越来越多的证据表明,由于该技术易产生假阳性信号使得RNA的检测灵敏度显著降低。本文就如何克服这些缺陷,实现活体细胞中RNA的高灵敏检测来构建分子信标进行了阐述。

皮肤光学相干断层成像技术和应用进展

光学相干断层成像(optical coherence tomography,OCT)通过测量被散射光的回波,对生物组织内部的微结构进行高分辨率、横断面和三维体积成像[1]。OCT是目前最具创新性的光学成像方式之一,因为其与组织学检查不同,可无创地利用活体组织中丰富的形态学和组织功能信息,进行重复成像以阐明病变性质和病情进展情况,监测治疗反应。随着细胞水平OCT技术进入临床应用,由于其具有极佳的分辨率和穿透深度,可用于诊断所有类型的皮肤肿瘤[2]。目前OCT凭借可进行“光学活检”即组织微观结构和病理的实时原位可视化而不需要离体和处理标本的优势,已发展成为生物医学光学和医学的重要光学成像技术。

CRISPR/Cas9系统在临床医学研究的应用与改进

癌症与遗传疾病等难治性疾病的发生发展一般是多因素协同的结果,涉及复杂的信号网络及多生物分子的相互作用。了解其中驱动的关键元素有助于为临床上的治疗和研究打开新的突破口。然而,探究驱动元素用于难治性疾病治疗的挑战之一是缺乏方便、可编程的基因编辑工具。近年来,新型的CRISPR/Cas9系统由于其组分简单、基因编辑效率高等特点逐渐成为临床医学研究中应用最为广泛的基因编辑工具。本文介绍了CRISPR系统应用于临床研究中的相应进展和潜在挑战。阐述了基于CRISPR系统sgRNA序列重构能改变靶向性及系统本身的可编程性等特性,其可在进行适当的改造和修饰后实现对活细胞染色体的实时成像,用以了解生物体在面临外界刺激时基因组的时空调节。评估了CRISPR系统在基因筛选、免疫治疗和遗传疾病治疗方面的重大价值,尤其是CRISPR系统进行相应改造后系统用在临床研究中安全性与功能性的提升。介绍了CRISPR系统在临床研究中的应用障碍、局限以及对其相应的优化改造,展望CRISPR/Cas9基因编辑技术的应用前景及其在临床医学领域的发展优势,以期能为CRISPR系统的进一步应用与优化提供参考。

人胃癌裸鼠原位移植瘤模型的建立及其活体荧光成像检测

目的:建立可动态实时监测的人胃癌裸鼠原位移植瘤模型。方法:将稳定表达荧光素酶的人胃癌细胞SGC-7901^(fLuc+)注入裸鼠后肢根部皮下形成皮下移植瘤。待皮下移植瘤瘤块长至直径0.5 cm时,剥取肿瘤组织,应用叠合法将瘤块原位移植于裸鼠胃小弯处,形成原位移植瘤模型。利用小动物活体荧光成像系统,每4日监测移植瘤的进展情况。荷瘤3周后,解剖荧光成像阳性小鼠,利用H-E染色、光镜下观察移植瘤的形态。结果:应用小动物活体荧光成像系统,可在荷瘤裸鼠胃部检测到逐渐增强的荧光信号。荷瘤裸鼠胃部存在肿瘤包块贴附于胃壁,包块直径为0.5~1.0 cm,包块周围与相邻组织器官边界清晰,未见粘连,检查腹腔未见转移,未见腹水形成。应用叠合法构建人胃癌裸鼠原位移植瘤模型成功率为95%(19/20)。对荷瘤胃组织H-E染色后,可见异常肿瘤细胞,肿瘤包膜完整,符合胃癌组织学特征。结论:成功建立了操作简便、成瘤率高的可动态监测的人胃癌裸鼠原位移植瘤模型,为研究胃癌发生机制、研发抗癌药物提供了理想的实验工具。

mRNA单分子动态成像技术研究进展

转录后成熟的mRNA与RNA结合蛋白结合,形成信使核糖核蛋白复合物,之后在胞质内沿细胞骨架转运并定位到亚细胞特定区域。在此过程中,mRNA的转运及调控对于mRNA的功能、蛋白质的定位和细胞极性生长的维持发挥着重要的作用。近年来,活细胞单分子成像技术的发展,为人们深入了解mRNA的动态调控提供了新的契机。通过对活细胞中mRNA和RNA结合蛋白的标记,我们不仅可以检测mRNA的动力学特征,还可以原位检测新合成的蛋白质。本文主要介绍mRNA的定位和翻译过程,重点叙述单分子动态成像技术在分析mRNA动态调控中的应用。活细胞单分子成像技术可以揭示mRNA翻译的动力学特性,并促进我们对mRNA命运的理解,为后续研究mRNA的动态调控提供参考。

转录因子及其动态成像分析技术的研究进展

转录因子是通过直接或间接的方式与顺式作用元件相互作用,从而对靶基因进行调控的一组蛋白。由于转录因子在植物生长发育、响应外界刺激等方面发挥着重要作用,其结构和动态特征一直作为研究的重点。转录因子的基本特征被逐渐揭示,然而关于它们之间是如何响应特定的信号而表现出不同的动态特征,在很大程度上仍是未知的。近年来,随着活细胞单分子成像技术的发展,为学者深入了解转录因子间的动态调控提供了新的契机。本文主要介绍了转录因子的结构特征和研究方法,重点叙述了单分子动态成像技术在分析转录因子动态调控中的应用,以期为后续研究转录因子的动态调控过程提供参考。

新型光学显微镜突破分辨率极限——可用于观察活细胞生理过程

科技日报北京电（记者常丽君）据美国科罗拉多州立大学官网报道,近日该校科学家演示了一种空间分辨率达2η（η是非线性光强反应单位最高级）的多光子—空间频率调制成像（MP-SPIFI）技术,突破了光学显微成像分辨率极限。超分辨率显微成像技术因克服衍射极限荣获2014年诺贝尔化学奖,但需要将单个荧光分子的衍射精确控制在极限范围内。研究人员考虑了另一种现已成熟的深组织成像技术——多光子显微成像,这种方法能获得标准超分辨率技术无法提供的样本信息。

新型成像技术

美国科学家运用类似X光CT扫描的方法，开发出一种新型成像技术，可在不用荧光标记或其他外加对比试剂的情况下展现活细胞内的任何活动。该技术使人类首次能够对活体细胞在自然状态下的各种功能加以研究。